程漢良 姬南京 彭永興 申 欣 吳陳晨 許建和 董志國

(淮海工學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，連云港 222005)

葡萄糖激酶(glucokinase，GK，EC2.7.1.1)是糖代謝的關(guān)鍵酶，催化葡萄糖磷酸化生成6－磷酸葡萄糖(glucose-6-phophate，G-6-P)，這是糖元合成和糖酵解的第1步反應(yīng)［1］。GK屬己糖激酶(hexokinase，HK)家族成員之一，哺乳動物己糖激酶有同工酶Ⅰ～Ⅳ型，其中，Ⅰ～Ⅲ型主要存在于肝外組織，其Km值(Km值等于酶促反應(yīng)速度達到最大反應(yīng)速度1/2時所對應(yīng)的底物濃度，是酶的特征常數(shù)之一)為20～130μmol/L，G-6-P是其反饋抑制物;Ⅳ型主要存在于肝臟和胰島β細胞，通常稱之為GK。與其他3種已糖激酶相比，GK對葡萄糖的親和力較低，其Km值為5～8 mmol/L，G-6-P對此酶無抑制作用［2］。當(dāng)血糖濃度升高時啟動GK，于是多余的葡萄糖最終被轉(zhuǎn)化為糖原或脂肪貯存，胰島素在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控GK基因表達［3］，GK 基因突變可引起人類患 2 型糖尿?。?］。在魚類中，特別是肉食性魚類，對飼料中可消化碳水化合物作為能量供應(yīng)的能力非常有限［5－6］，一些魚類攝食富含碳水化合物飼料后會出現(xiàn)高血糖癥［7－8］，飼料碳水化合物過高還可能是誘發(fā)養(yǎng)殖魚類脂肪肝病發(fā)生的原因之一［9］，而GK基因因可能與上述問題有關(guān)而受到重視。目前，研究人員已對魚類GK基因進行了一些研究，克隆了虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、金鯛(Sparus aurata)、翹嘴紅鮊(Erythroculter ilishaeformis)等魚類的GK基因全長 cDNA 序列［10－12］，并對影響 GK 基因表達的營養(yǎng)和環(huán)境等因素進行了研究，為魚類碳水化合物代謝調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

彭澤鯽(Carassius auratus var.Pengze)是我國鯽魚主要養(yǎng)殖品種。近幾年，隨著集約化養(yǎng)殖程度的提高，用于魚類飼料蛋白質(zhì)源的魚粉資源不斷減少。因此，優(yōu)化飼料配方，提高碳水化合物用于能量消耗的比例，節(jié)約蛋白質(zhì)的消耗，促進養(yǎng)殖魚類健康生長，預(yù)防脂肪肝病的發(fā)生成為魚類營養(yǎng)研究的熱點。本研究從彭澤鯽肝胰臟中克隆GK基因全長cDNA序列，并對其組織表達進行研究，以期為通過營養(yǎng)調(diào)控魚類GK基因表達研究奠定基礎(chǔ)。由于GK把糖代謝和脂肪合成關(guān)聯(lián)起來，因此，通過對GK基因的研究還可為探討魚類脂肪肝發(fā)生的營養(yǎng)機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用彭澤鯽于2008年5月采自江蘇連云港市羅陽鎮(zhèn)的精養(yǎng)魚池，2齡，體重0.3～0.5 kg。運回實驗室后于全自動水族箱中25℃暫養(yǎng)，適量投喂商品顆粒飼料，并于喂食后6 h取樣。

1.2 肝胰臟總RNA的提取

取彭澤鯽活體解剖，快速分離肝胰臟，液氮研磨，采用 E.Z.N.A.TMTotal RNA kit I(OMEGA，USA)按推薦方法提取肝胰臟總 RNA，按膜上DNaseⅠ(OMEGA，USA)消化處理方案去除基因組DNA污染，1%瓊脂糖電泳檢測RNA完整性，核酸定量儀(PE，USA)檢測RNA濃度，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水稀釋至1μg/μL，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 cDNA第1鏈的合成和GK基因cDNA核心片段序列的克隆

以彭澤鯽肝胰臟總RNA為模板，Oligo(dT)18為反轉(zhuǎn)錄引物，使用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit(BBI，Canada)推薦方法合成cDNA第1鏈，20μL反應(yīng)體系中含:彭澤鯽肝胰臟總RNA(1 μg/μL)5 μL、Oligo(dT)181 μL、DEPC 水5 μL、5×Buffer 4 μL、RNase抑制劑 1 μL、dNTP(10 mmol/L)2μL、AMV反轉(zhuǎn)錄酶2μL。根據(jù)GenBank中斑馬魚(Danio rerio，BC122359)和鯉魚(AF053332)GK基因保守序列設(shè)計1對基因特異性引物GK-F和GK-R，并根據(jù)斑馬魚 GK基因序列預(yù)測PCR產(chǎn)物大小(表1)，以上述第1鏈cDNA稀釋10倍為模板，PCR擴增彭澤鯽GK基因一段855 bp的核心序列，50μL反應(yīng)體系中含:模板2μL、濃度為25μmol/L的上下游引物各1μL、10×Buffer 5μL、濃度為 25 mmol/L的 Mg2+4μL、濃度為 25 mmol/L的 dNTP 1μL、濃度為5 U/μL的Taq酶0.4 μL，去離子水補充至50 μL。擴增條件為:94℃變性40 s、52℃退火40 s、72℃延伸60 s，共30個循環(huán);反應(yīng)前 94℃預(yù)變性4 m in;反應(yīng)后72℃充分延伸7 m in。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選5個PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(上海生工)采用擴增引物進行正反雙向測序。正反序列組裝后得到GK基因的核心序列，并根據(jù)此序列設(shè)計3'cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)和5'RACE的引物。

表1 用于GK基因cDNA RT-PCR和RACE的引物序列及預(yù)期產(chǎn)物大小Table 1 Primer sequence and expected product size for GK gene cDNA RT-PCR and RACE

1.4 彭澤鯽GK基因3'RACE

使用 TaKaRa的3'-Full RACE Core Set試劑盒，按推薦方法快速擴增GK基因3'末端，3'RACE使用的引物見表1。首先，以O(shè)ligo(dT)16AP為引物反轉(zhuǎn)錄肝胰臟總RNA，獲得cDNA第1鏈，稀釋10倍后，以GK3-F1和AP為引物進行第1輪PCR擴增。第1輪擴增產(chǎn)物稀釋10倍后，用GK3-F2與Race3-R進行第2輪PCR擴增，PCR反應(yīng)體系和條件同核心序列的擴增。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的條帶，膠回收方法采用EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit(BBI，Canada)推薦方法;然后用 PCR Product Cloning Kit(BBI，Canada)推薦方法將回收的 PCR產(chǎn)物與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，在含有青霉素，并涂有IPTG和X-gal的LB平板上培養(yǎng)16～20 h，挑白斑在含青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)16 h，使用EZ-10 Spin Column Plasm id M ini-preps Kit(BBI，Canada)提取質(zhì)粒，用 GK3-F2和Race3-R為引物進行PCR驗證，選5個陽性質(zhì)粒送上海生工采用M 13通用引物雙向測序。

1.5 彭澤鯽GK基因5'RACE

參考 Dieffenbach等［13］的方法快速擴增 GK基因5'末端，5'RACE使用的引物見表1。首先，以GK5-R為引物反轉(zhuǎn)錄肝胰臟總RNA，獲得cDNA第1鏈;然后用RNase H(Fermentas，Canada)分解cDNA-RNA雜交體中的RNA，乙醇沉淀;再使用末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(Fermentas，Canada)在5'端加多聚A(polyA)尾，20μL反應(yīng)體系如下:在有沉淀的原管中加入5×Buffer 4μL、dATP(100 mmol/L)1μL、末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(20 U/μL)1.5 μL，無菌水補至 20 μL。反應(yīng)條件為:37℃溫育30 m in，70℃滅活10 m in，用 TE緩沖液稀釋10倍后備用;最后，以O(shè)ligo(dT)16AP和GK5-R1為引物進行第1輪PCR擴增，第1輪擴增產(chǎn)物稀釋10倍后，用Race3-R與GK5-R2進行第2輪PCR擴增，PCR反應(yīng)體系和條件同核心序列擴增。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的條帶并回收，克隆測序，方法同3'RACE。

1.6 序列分析

用 DNAstar Package(Version 5.01)軟件包中的SeqMan對正反序列進行組裝，當(dāng)正反序列出現(xiàn)不配對情況時，查閱熒光圖譜進行校正，分別得到GK基因cDNA的核心序列、3'末端序列和5'末端序列，然后用SeqMan將3段序列組裝成完整的GK基因全長cDNA序列。用EditSeq對得到的序列進行編輯和分析，尋找開放閱讀框(ORF)，并使用脊椎動物密碼子翻譯成氨基酸序列。通過查詢http://www. predictprotein.org/和 http//www.EMBL-Heidelberg.de對編碼蛋白質(zhì)的2級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測;從GenBank下載6種魚類、10種哺乳類、1種鳥類和1種兩棲類動物的GK氨基酸序列，與本研究獲得的彭澤鯽氨基酸序列用MEGA Version 3.1采用鄰接(neighbor-joining，NJ)法(Amino:pdistance model，10 000 replicates，boostrap phylogeny test)［14］構(gòu)建基于 GK氨基酸序列的分子系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 彭澤鯽GK基因在不同組織的表達

取3尾彭澤鯽活體解剖，快速分離大腦、白肌、脾臟、腸系膜脂肪和肝胰臟等組織，分別提取總RNA，按膜上DNaseⅠ消化處理方案去除基因組DNA污染，1%變性瓊脂糖電泳檢測RNA完整性，核酸定量儀檢測RNA質(zhì)量和濃度，用DEPC水稀釋至1μg/μL。分別以O(shè)ligo(dT)18反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，稀釋10倍，用 GK-F1與 GK-R為引物進行PCR擴增。同時，以β-actin為內(nèi)標(biāo)，用Actin-F和Actin-R為引物(表1)在不同管中進行PCR擴增，25μL反應(yīng)體系中含:模板1μL、濃度為25μmol/L的上下游引物各 0.5μL、10×Buffer 2.5μL、濃度為25 mmol/L 的 Mg2+2 μL、濃度為 25 mmol/L 的 dNTP 0.5 μL、濃度為5 U/μL的Taq酶0.2 μL，去離子水補充至25 μL。擴增條件為:94℃變性30 s、52℃退火30 s、72℃延伸40 s，共28個循環(huán);反應(yīng)前 94℃預(yù)變性4 m in;反應(yīng)后72℃充分延伸7 m in。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。為避免樣品中的DNA污染，各組均設(shè)以總RNA為模板的陰性對照1個。

2 結(jié)果與分析

2.1 彭澤鯽GK基因全長cDNA序列分析

對GK cDNA核心序列以及克隆的3'RACE和5'RACE的PCR產(chǎn)物進行測序，分別得到長度為855、965和373 bp核苷酸片段。將上述3段序列進行組裝，去掉重復(fù)序列后得到彭澤鯽GK基因全長 cDNA序列，并提交 GenBank(登錄號:GU065315)，其全序列和推測的氨基酸序列如圖1所示。該cDNA全長2 050 bp(不含polyA)，含有1 431 bp的完整開放閱讀框，編碼476個氨基酸，其中，5'端非翻譯區(qū) 67 nt，3'端非翻譯區(qū) 552 nt。在啟始密碼子ATG的－3位為A，－6位為G，符合Kozak規(guī)則，在該閱讀框終止密碼子TGA下游有典型的AATAAA加尾信號，這些都符合有效翻譯基因全長cDNA的特征。

彭澤鯽GK蛋白計算分子量為53.78 ku，等電點為5.14。其氨基酸序列中可能的基序包括:1個己糖激酶標(biāo)簽序列(hexokinases signature)，Leu156-Phe181;2個N－連接糖基化位點(N-linked glycosylation site)，Asn176和 Asn214;1個細胞黏附序列(cell attachment sequence)，Arg202-Asp204;1個糖胺聚糖黏附位點(glycosam inoglycan attachment site)，Ser455-Gly458;4個蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(phosphorylation site);9個酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)磷酸化位點;10個N－連接酰基化位點(N-linked myristoylation site)。彭澤鯽GK氨基酸序列與其他脊椎動物相比有極高的相似性，與建鯉(C.carpio var.Jian)、翹嘴紅鲌、虹鱒、金鯛、人(Homo sapiens)、大鼠(Rattus norvegicus)和爪蟾(Xenopus laevis)的相似百分比分別為98.1%、95.4%、86.0%、85.7%、79.8%、79.1%和79.3%。

圖1 彭澤鯽G K基因全長cDNA序列及其翻譯的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide sequence of GK gene full-length cDNA and the deduced am ino acid sequences in C.auratus var.Pengze

2.2 基于GK基因編碼氨基酸序列的聚類分析

基于7種魚類、11種內(nèi)溫動物和1種兩棲類動物GK基因編碼氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，其拓撲結(jié)構(gòu)顯示:作為低等脊椎動物，所有魚類聚為一枝，與高等動物分開。在魚類，同屬鯉科的建鯉、彭澤鯽、翹嘴紅鲌、斑馬魚和草魚(Ctenopharyngodon idella)聚為一枝，自展支持率為100%，而同屬真骨魚類的虹鱒和金鯛聚為一枝。在內(nèi)溫動物，同屬靈長類的人、黑猩猩(Pan troglodytes)和獼猴(Macaca mulatta)聚為一枝，自展支持率99%，然后所有的哺乳動物聚為一枝與鳥綱的家雞(Gallus gallus)分開，最后哺乳動物和家雞等內(nèi)溫動物聚為一枝，自展支持率99%，與兩棲類的爪蟾分開(圖2)。由GK氨基酸序列所反映的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與傳統(tǒng)分類基本一致。

圖2 采用NJ法基于GK氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on glucokinase am ino acid sequences using NJmethod

2.3 彭澤鯽GK基因的組織表達

通過半定量RT-PCR方法對GK基因在大腦、白肌、脾臟、腸系膜脂肪和肝胰臟等組織中的表達進行了研究，結(jié)果如圖3所示?？芍?，GK基因主要在肝胰臟中表達;同時，在脾臟、腸系膜脂肪和大腦中也檢測到微量表達，但GK基因表達量顯著低于肝胰臟(P＜0.05);白肌中沒有檢測到GK基因表達。而陰性對照組沒有擴增產(chǎn)物(結(jié)果未顯示)，表明沒有基因組DNA污染。

圖3 GK基因在彭澤鯽不同組織中的表達Fig.3 Expression of GK mRNA in different tissues of C.auratus var.Pengze

3 討論

3.1 GK肽鏈與其他脊椎動物比較

本研究采用RT-PCR和RACE方法從彭澤鯽肝胰臟中克隆了GK基因全長cDNA序列，該cDNA編碼476個氨基酸。將彭澤鯽GK氨基酸序列與人、大鼠、爪蟾、建鯉、翹嘴紅鲌、虹鱒和金鯛等脊椎動物的GK氨基酸序列進行比對，結(jié)果見圖4。

哺乳動物GK分子量約50 ku，是己糖激酶Ⅰ～Ⅲ型的1/2，只含1個結(jié)構(gòu)域，大鼠GK與腦己糖激酶Ⅰ型的C－端有75%的相似性［15］。己糖激酶基因家族催化葡萄糖生成G-6-P的ATP依賴型磷酸化反應(yīng)，是糖酵解途徑的限速酶，控制糖代謝的第1步反應(yīng)。與己糖激酶Ⅰ～Ⅲ型不同，GK不受產(chǎn)物G-6-P的反饋抑制，因此，GK在肝細胞和胰島β細胞中作為葡萄糖傳感器和代謝發(fā)生器具有重要生理功能［2］。GK主要功能位點包括:ATP結(jié)合位點、葡萄糖結(jié)合位點、N－連接糖基化位點等。大鼠GK氨基酸殘基Asp78-Lys90以及13個氨基酸之后的Lys102(大鼠氨基酸殘基編號)對于與ATP結(jié)合非常重要［15］，包括彭澤鯽在內(nèi)的所有物種這一結(jié)構(gòu)域非常保守。在人類，GK氨基酸殘 基 Ser152-Pro154、Asn167-Lys170、Asn205-Thr207、Ile226-Asn232、Asn255-Gly259、Gln288及 Glu291(人氨基酸殘基編號)被認為是葡萄糖結(jié)合位點，特別是葡萄糖的所有氧原子與GK氨基酸殘基Thr169、Lys170、Asn205、Asp206、Asn232、Glu257及 Glu291(人氨基酸殘基編號)形成氫鍵［2，16］，上述氨基酸殘基在所有脊椎動物中保守。

GK還含有1個保守的己糖激酶標(biāo)簽序列(Leu147-Phe162，人氨基酸殘基編號)，在這些氨基酸殘基中，除了Ile159在鯉科魚類被Leu替代外，其他氨基酸殘基在所有脊椎動物中基本保守。此外，所有脊椎動物GK氨基酸序列中都具有保守的N－連接糖基化位點(Asn167和Asn205，人氨基酸殘基編號);細胞黏附序列(Arg193-Asp195，人氨基酸殘基編號)和糖胺聚糖黏附位點(Ser446-Gly449，人氨基酸殘基編號)。爪蟾GK氨基酸殘基Glu51Glu52及His141-Leu144(爪蟾氨基酸殘基編號)被認為是調(diào)控蛋白結(jié)合位點［16］，除 Glu51外，其他氨基酸殘基在所有物種中也保守。

3.2 GK基因的組織表達

哺乳動物GK主要存在于肝和胰島β細胞，胰島素在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控其表達。魚類肝胰臟GK基因僅在第1次喂食碳水化合物飼料后誘導(dǎo)表達，這與己糖激酶Ⅰ型基因從受精卵到胚后發(fā)育的各個階段均表達不同［17］;虹鱒GK基因僅在肝臟和下丘腦中表達，并受營養(yǎng)條件調(diào)控，饑餓抑制GK基因表達，再攝食促進GK基因表達，喂食后6 h GK基因表達出現(xiàn)高峰，說明肉食性虹鱒魚對飼料中碳水化合物利用率較低的原因不是肝臟缺乏可誘導(dǎo)的GK基因［18］。本研究結(jié)果表明，鯽魚GK基因主要在肝胰臟中表達，但脾臟、腸系膜脂肪和大腦中也檢測到微量表達，白肌中沒有檢測到GK基因的表達，這與虹鱒GK基因僅在肝臟和下丘腦中表達結(jié)果不同，因此，GK基因在魚類的組織表達還需進一步研究。虹鱒肝臟GK活性及其基因水平隨飼料淀粉或葡萄糖的增加而提高［19－21］;肉食性的金鯛通過GK的調(diào)節(jié)，可忍受飼料中蛋白質(zhì)被碳水化合物部分代替［22－23］，饑餓降低金鯛肝GK基因表達水平，而飼喂高碳水化合物低蛋白質(zhì)飼料或用胰島素處理可促進 GK基因表達［7，24］。溫度升高也可促進金鯛GK基因表達［25］。

圖4 彭澤鯽與人、大鼠、爪蟾、建鯉、翹嘴紅鲌、虹鱒和金鯛GK基因編碼氨基酸序列比對Fig.4 Multiple alignment of the GK gene deduced am ino acid sequence from C.auratus var.Pengze w ith the corresponding sequences from Homo sapiens，Rattus norvegicus，Xenopus laevis，C.carpio Var.Jian，E.ilichaeformis，O.mykiss and S.aurata

4 結(jié)論

本研究從雜食性的成年鯽魚肝胰臟中克隆了GK基因全長cDNA，其編碼氨基酸序列的主要功能位點(ATP結(jié)合位點、葡萄糖結(jié)合位點、N－連接糖基化位點等)在硬骨魚類及其他脊椎動物間高度保守，并證實了GK基因主要在彭澤鯽肝胰臟中表達，脾臟、腸系膜脂肪和大腦中微量表達，白肌中不表達。

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