張 勇 陶 亮 崔 巖 朱宇旌 鄧 科 孫 璀 邵彩梅

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866;2.遼寧禾豐牧業(yè)股份有限公司，沈陽(yáng) 110164)

保證肉品質(zhì)是保障養(yǎng)殖業(yè)、肉類加工業(yè)、批發(fā)零售業(yè)效益及廣大消費(fèi)者的切身利益的重要因素，對(duì)肉品質(zhì)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)調(diào)控是當(dāng)今動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin，CaN)、鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)和活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)共同構(gòu)成了鈣調(diào)磷酸酶－活化T細(xì)胞核因子(CaNNFAT)信號(hào)途徑，這一途徑在調(diào)節(jié)骨骼肌生長(zhǎng)，決定肌纖維類型特征中起著重要作用［1］。鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)是內(nèi)源性的，需要Ca2+信號(hào)來(lái)活化。它可以抑制肌肉內(nèi)蛋白質(zhì)降解，降低肌細(xì)胞生長(zhǎng)速度;動(dòng)物被屠宰后，它可抑制鈣蛋白酶的活性，降低蛋白質(zhì)水解［2］。CaN是受Ca2+信號(hào)活化的一種多功能信號(hào)酶，激活的CaN可以使NFAT的多個(gè)絲氨酸殘基去磷酸化，從而導(dǎo)致NFAT的構(gòu)象發(fā)生變化，促使NFAT在細(xì)胞核內(nèi)定位并使DNA結(jié)合功能域暴露，轉(zhuǎn)錄因子NFAT脫磷酸而活化而進(jìn)入核內(nèi)［3］。近年來(lái)，大部分的研究都集中在Ca2+-CaN-NFAT信號(hào)途徑在骨骼肌生長(zhǎng)、發(fā)育及功能維持中的生物學(xué)功能［4－8］，有關(guān) CAST作為肉質(zhì)候選基因在研究牛、豬等哺乳動(dòng)物中有所報(bào)道［9－12］，而飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)CAST和CaN-NFAT信號(hào)途徑相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)量的影響以及CaN-NFAT信號(hào)途徑與肌肉嫩度的關(guān)系都鮮有報(bào)道。本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR(real time-PCR，RT-PCR)方法，以β－肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，研究飼糧中不同蛋白質(zhì)水平對(duì)CAST、CaN、NFAT和CaM mRNA在背最長(zhǎng)肌相對(duì)表達(dá)量的影響，明確CAST與CaN-NFAT信號(hào)途徑在豬肌肉嫩度調(diào)控中的作用，為改善豬肉品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

數(shù)顯式肌肉嫩度儀(C－LM 3型，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院研制);高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(TGL－20M，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司);紫外分光光度計(jì)(Cary 50 Probe，美國(guó)Varian公司);基因擴(kuò)增儀［TC－96/G/H(6)，杭州博日科技有限公司］;PCR儀(ABIPRISM 7000 HT Real-Time RCRSystem，美國(guó)ABI公司);凝膠成像系統(tǒng)(江蘇捷達(dá))。

1.2 試驗(yàn)試劑

RNA提取試劑盒(RNAiso Reagent)、RT-PCR試劑盒［SYBRPrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)］、DEPC 水、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)、50 bp DNA Ladder Marker均購(gòu)自于TaKaRa公司;瓊脂糖購(gòu)自于寶泰克(西班牙)公司;其他常用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇初始重約50 kg的杜洛克×長(zhǎng)白×大白三元雜交豬90頭，隨機(jī)分配到3個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭，公母各占1/2。3個(gè)處理分別采用12%、16%、20%理想蛋白質(zhì)水平的飼糧，飼糧能量水平相同，正試期58 d，參照NRC(1998)肥育豬的營(yíng)養(yǎng)需要配合成粉狀全價(jià)料，飼糧消化能保持相同。飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of diets(air-dry basis) %

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)前進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)、防疫、編號(hào)等工作。試驗(yàn)豬水泥地面單圈飼養(yǎng)，自由采食，以鴨嘴式飲水器提供充足清潔飲水，日飼喂3次，清糞3次，保持舍內(nèi)清潔，隨時(shí)觀察并記錄飼養(yǎng)期間豬的食欲、精神狀況、糞便等情況。

1.5 樣品采集

為了使胴體盡量少受破壞，肉樣采集位置為豬最后肋骨和最后腰椎間的單側(cè)背最長(zhǎng)肌，采樣400 g，用于肉品質(zhì)測(cè)定;并在最短的時(shí)間內(nèi)于第13～16肋骨間取豬背最長(zhǎng)肌樣本30 g，放入錫箔紙中包好，用液氮迅速冷凍，之后放于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 肌肉嫩度的測(cè)定

采用C－LM 3型數(shù)顯式肌肉嫩度儀測(cè)定肉樣剪切力，具體試驗(yàn)方法參考張勇等［13－14］文獻(xiàn)。

1.7 RT-PCR法測(cè)定相關(guān)蛋白m RNA表達(dá)量

1.7.1 總 RNA 提取

參照RNA提取試劑盒推薦方法，提取豬背最長(zhǎng)肌樣品總RNA。提取后的RNA用紫外分光光度計(jì)在260和280 nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)OD260nm/OD280nm檢驗(yàn)純度，并按如下公式計(jì)算RNA的濃度:

1.7.2 cDNA 合成

按照RT-PCR試劑盒操作方法進(jìn)行。cDNA合成后放－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.3 引物設(shè)計(jì)與合成

β-actin、CaN、NFAT、CaM 和 CAST 的引物序列及參數(shù)見(jiàn)表2。引物均由上海生工有限公司合成。

1.7.4 RT-PCR

參照試劑盒操作說(shuō)明，采用SYBR Green熒光染料法，在RT-PCR儀上進(jìn)行相對(duì)定量分析。反應(yīng)條件:94℃變性30 s，58～62℃退火30 s(具體基因的退火溫度見(jiàn)表2)，72℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)。

表2 引物序列及實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件Table 2 Primer sequences and the conditions for real-time PCR

1.7.5 相對(duì)表達(dá)量計(jì)算

目的基因相對(duì)表達(dá)量按以下公式計(jì)算:

目的基因相對(duì)表達(dá)量=2－△△Ct。

式中:Ct為閾值循環(huán)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所的ABI Prism 7000 SDS software 1.5進(jìn)行相對(duì)定量分析，PCR反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)生成報(bào)告，采用文獻(xiàn)中相對(duì)定量 2－△△Ct法［15］計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用LSD法和Duncan氏法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 背最長(zhǎng)肌剪切力及 CAST、CaN、CaM 和NFAT m RNA表達(dá)量

由表3可知，12%組肌肉剪切力顯著低于20%組(P＜0.05)，16%組與其他組差異不顯著(P＞0.05)，肌肉剪切力隨飼糧蛋白質(zhì)水平升高而增加，即蛋白水平越高肌肉嫩度越差。20%組的CAST和CaN mRNA表達(dá)量極顯著高于12%組和16%組(P＜0.01)，12%組與16%組差異不顯著(P＞0.05)，CAST和 CaN mRNA在背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量隨飼糧蛋白水平升高而增加;NFAT和CaM mRNA表達(dá)量在3個(gè)處理組間差異不顯著(P ＞0.05)。

表3 飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)豬背最長(zhǎng)肌剪切力、CaN、NFAT、CaM和CAST m RNA相對(duì)表達(dá)量的影響Table 3 Effects of dietary protein level on the shear force and mRNA relative expression levels of CaN，NFAT ，CaM and CAST of longissimus dorsi in finishing pigs

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P＜0.05)，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P＜0.01)，相同字母表示差異不顯著(P ＞0.05)。

In the same row，valuesw ith different small superscriptsmean significant difference(P ＜0.05)，and w ith different capital letter superscriptsmean significant difference(P ＜0.01)，while w ith the same letter superscriptsmean no significant difference(P ＞0.05).

2.2 背最長(zhǎng)肌剪切力與 CaN、NFAT、CaM 和CAST m RNA表達(dá)量相關(guān)性

由表4可知，背最長(zhǎng)肌剪切力與CAST mRNA表達(dá)量極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，相關(guān)系數(shù)為0.713;背最長(zhǎng)肌剪切力與 CaN、CAM 和 NFAT mRNA表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)分別為0.439、0.135和0.374，無(wú)顯著相關(guān)(P ＞ 0.05)。CaN、CaM 與CAST mRNA表達(dá)量顯著正相關(guān)(P＜0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為 0.594、0.596;NFAT 與 CAST mRNA表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)為0.376，無(wú)顯著相關(guān)(P＞0.05)。NFAT、CaM 與CaN mRNA表達(dá)量顯著正相關(guān)(P ＜0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為 0.536、0.546。CaM與NFAT mRNA表達(dá)量顯著正相關(guān)(P＜0.05)，相關(guān)系數(shù)為 0.623。

3 討論

3.1 飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)背最長(zhǎng)肌剪切力的影響

嫩度是肉品質(zhì)的一種感官特征，也是其食用質(zhì)量與商業(yè)價(jià)值的重要指標(biāo)。它來(lái)源于肌束的結(jié)構(gòu)和生化特性，特別是肌原纖維和中等細(xì)絲的結(jié)構(gòu)和生化特性，以及肌間結(jié)締組織。肉的嫩化是尸僵發(fā)生后一定時(shí)間內(nèi)，肌纖維碎裂、肌肉重新變軟、嫩度增加的過(guò)程［16］。肌肉嫩度的評(píng)定通常采用肉的咬力值和剪切力來(lái)表示。Goerl等［17］研究了飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)28～104 kg豬肉品質(zhì)的影響，同樣發(fā)現(xiàn)隨飼糧蛋白質(zhì)水平的增加胴體背膘厚下降、瘦肉率增加、肉嫩度下降。Davey等［18］研究發(fā)現(xiàn)，用高蛋白質(zhì)飼糧飼喂瘦肉型豬，可提高瘦肉率、降低肌肉內(nèi)脂肪水平、降低肉的嫩度。張克英等［19］報(bào)道生長(zhǎng)肥育豬60 kg后飼糧采用理想蛋白質(zhì)水平12%，可獲得較好的豬肉品質(zhì)，在此基礎(chǔ)上，適當(dāng)降低飼糧蛋白質(zhì)水平有利于改善豬肉的風(fēng)味和嫩度，但進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)水平，則可能影響豬肉品質(zhì)，這與本試驗(yàn)的結(jié)果相似，隨著飼糧蛋白質(zhì)水平的升高，剪切力值上升，表明提高蛋白質(zhì)水平對(duì)改善肌肉的嫩度有著負(fù)面影響。

3.2 飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)背最長(zhǎng)肌CAST和CaNNFAT信號(hào)途徑相關(guān)蛋白m RNA表達(dá)量的影響

鈣蛋白酶系統(tǒng)由一系列的鈣蛋白酶和CAST構(gòu)成。鈣蛋白酶是肌原纖維蛋白質(zhì)降解過(guò)程中的關(guān)鍵酶。CAST可抑制鈣蛋白酶的活性，當(dāng)鈣蛋白酶被Ca2+激活后，如果附近有CAST存在，將迅速與之結(jié)合，影響其自溶穩(wěn)定性，抑制鈣蛋白酶的活性，從而保證鈣蛋白酶只進(jìn)行局部的特定位點(diǎn)的水解。Thomson等［20］報(bào)道，營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)斷奶閹公羊骨骼肌鈣蛋白系統(tǒng)活性均無(wú)影響，但肌肉蛋白質(zhì)沉積速度與CAST活性呈正相關(guān)，肌肉蛋白質(zhì)降解速度與鈣激活酶Ⅰ(μ-calpain)活性呈負(fù)相關(guān)。用不同蛋白質(zhì)水平的飼糧飼喂56只狗，經(jīng)過(guò)70 d后檢測(cè)得到CAST在狗的骨骼肌中表達(dá)量隨著蛋白質(zhì)水平的提高而呈上升趨勢(shì)［21］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧蛋白質(zhì)水平與背最長(zhǎng)肌CAST mRNA表達(dá)量有一定的相關(guān)，隨著蛋白質(zhì)水平的升高背最長(zhǎng)肌CAST mRNA表達(dá)量增加，反映了蛋白質(zhì)水平的提高可加快肥育豬的蛋白質(zhì)沉積，從而抑制鈣蛋白酶對(duì)肌原纖維蛋白質(zhì)的降解。這一結(jié)論與 Thomson 等［20］在羊的試驗(yàn)報(bào)道和 Helman 等［21］在狗的試驗(yàn)報(bào)道一致。

表4 豬背最長(zhǎng)肌剪切力、CaN、NFAT、CaM和CAST m RNA相對(duì)表達(dá)量回歸方程Table 4 Regression equations of shear force and mRNA relative expression levels of CaN，NFAT，CaM and CAST of longissimus dorsi in finishing pigs

CaN-NFAT信號(hào)途徑是調(diào)節(jié)骨骼肌生長(zhǎng)，決定肌纖維類型特征的主要信號(hào)途徑。本課題組曾研究了不同飼喂方式以及不同飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì)豬骨骼肌中CAST和鈣蛋白酶mRNA表達(dá)量的影響［13－14］，而就飼糧蛋白質(zhì)水平對(duì) CaN-NFAT 信號(hào)途徑相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)量的影響國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)中，隨飼糧蛋白質(zhì)水平的升高豬背最長(zhǎng)肌 CaN mRNA表達(dá)量顯著增加，NFAT、CaM mRNA表達(dá)量隨CaN mRNA表達(dá)量增加而增加，且三者之間的變化相關(guān)性明顯，其原因可能是當(dāng)動(dòng)物攝入蛋白質(zhì)量增加，通過(guò)神經(jīng)刺激使得胞質(zhì)內(nèi) Ca2+濃度升高、CaN被激活，可以讓下游的NFAT家族成員脫磷酸并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使得CaM表達(dá)增加。由于CAST在不同類型纖維中的表達(dá)是不同的［22］，CAST的表達(dá)與CaN-NFAT信號(hào)途徑的關(guān)系如何是一個(gè)值得研究的課題。但目前這方面的研究報(bào)道極少，本試驗(yàn)的結(jié)果可為進(jìn)一步研究CAST與CaN-NFAT信號(hào)途徑之間的調(diào)控機(jī)理提供參考。

3.3 背最長(zhǎng)肌CAST和CaN-NFAT信號(hào)途徑對(duì)嫩度的影響

影響肉的嫩度的主要因素有肌節(jié)長(zhǎng)度、結(jié)締組織含量及肌肉結(jié)構(gòu)蛋白水解敏感性［23］。肉的嫩度是肌肉內(nèi)部結(jié)構(gòu)的反映，在一定程度上反映了肌原纖維、結(jié)締組織以及肌肉脂肪的含水量、分布和化學(xué)結(jié)構(gòu)［24］。CAST對(duì)鈣蛋白酶具有抑制作用，其分解產(chǎn)物對(duì)鈣蛋白酶也具有抑制作用，而鈣蛋白酶對(duì)肌肉纖維具分解作用，因此理論上它可以作為嫩度的候選基因。Koohmaraie等［25］研究認(rèn)為，高水平的CAST抑制宰后肌肉蛋白質(zhì)水解和嫩化。孫立彬等［26］對(duì)125頭豬進(jìn)行屠宰，通過(guò)CAST基因型與屠體性狀、肉質(zhì)性狀的相關(guān)性分析，得出CAST基因?qū)?nèi)脂肪含量具有顯著影響。武艷群等［27］試驗(yàn)進(jìn)一步證明CAST是與肉質(zhì)相關(guān)性非常高的候選基因。本試驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)CAST與肌肉剪切力存在顯著相關(guān)性，CAST mRNA表達(dá)量的增加降低了豬背最長(zhǎng)肌的嫩度。

隨著肉質(zhì)研究的發(fā)展，人們開(kāi)始關(guān)注肌纖維類型的特性及其分布規(guī)律，大量研究表明，肌纖維類型是決定肉品質(zhì)的重要因素［28－30］。CaN-NFAT信號(hào)途徑是調(diào)節(jié)不同纖維類型基因表達(dá)的關(guān)鍵機(jī)制，小鼠CaN基因敲除模型證實(shí)CaN-NFAT信號(hào)途徑可激活骨骼肌慢縮型纖維的基因表達(dá)［31］。對(duì)CaN-NFAT信號(hào)途徑而言，Ca2+濃度持續(xù)增高比短暫脈沖式增高更重要［32］，這意味著在快縮纖維和慢縮纖維中，不同的Ca2+環(huán)境所誘發(fā)的CaNNFAT信號(hào)系統(tǒng)反應(yīng)程度不同。CaN-NFAT信號(hào)通路被激活后，可以減輕肌營(yíng)養(yǎng)不良鼠(mdx鼠)肌肉萎縮病變的程度［33］。CaN可以促進(jìn)骨骼肌組織的再生。Sakuma等［34］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠的再生肌肉組織中，CaN活性及去磷酸化的NFAT含量均大幅度增加，得出Ca2+-CaN-NFAT信號(hào)途徑在肌肉的發(fā)生、發(fā)育及功能維持中非常重要。本試驗(yàn)中，CaN、NFAT、CaM mRNA表達(dá)量均隨剪切力的升高而呈增加趨勢(shì)，說(shuō)明CaN-NFAT信號(hào)途徑可能通過(guò)調(diào)節(jié)肌纖維的類型而在肌肉剪切力增高中起一定作用。對(duì)于CaN-NFAT信號(hào)途徑與肌肉嫩度的研究國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道，能否通過(guò)CaN-NFAT信號(hào)途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步調(diào)控肉品質(zhì)還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

①飼糧高蛋白質(zhì)水平顯著降低背最長(zhǎng)肌嫩度、提高CAST和CaN mRNA表達(dá)量。

②背最長(zhǎng)肌嫩度與CASTmRNA表達(dá)量正相關(guān)，CaN-NFAT信號(hào)途徑無(wú)相關(guān)性。

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