陳琳琳,劉維青,劉 靜,張高生,任宗明

(1.中國(guó)科學(xué)院 煙臺(tái)海岸帶研究所,山東 煙臺(tái) 264003; 2.黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局,山東 青島 266555;3.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所,山東 青島 266071)

自20世紀(jì)中后期,發(fā)達(dá)國(guó)家即開(kāi)始對(duì)環(huán)境中抗生素的含量及可能的生態(tài)效應(yīng)高度關(guān)注,并相繼建立了不同環(huán)境介質(zhì)中的抗生素濃度標(biāo)準(zhǔn)[1]。而中國(guó)相關(guān)方面的研究起步較晚,但隨著臨床醫(yī)學(xué)中抗生素使用劑量的不斷增大及耐藥性的出現(xiàn),國(guó)內(nèi)學(xué)者也開(kāi)始越來(lái)越關(guān)注抗生素的環(huán)境污染與生態(tài)毒性效應(yīng)[2-5]。抗生素的長(zhǎng)期使用會(huì)造成生態(tài)環(huán)境中耐藥性細(xì)菌及抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes,ARGs)的產(chǎn)生[6]。ARGs在生物體中可能長(zhǎng)久而持續(xù)地傳播,即使攜帶ARGs的細(xì)胞被殺滅或消亡,它釋放到環(huán)境中的DNA仍可能通過(guò)垂直傳播或水平轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)染給同屬或不同屬的其他細(xì)菌,進(jìn)而在環(huán)境中傳播、擴(kuò)散,從而對(duì)公共健康和食品衛(wèi)生、飲用水安全等構(gòu)成威脅[7-8]。眾多國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為ARGs在環(huán)境中的持續(xù)性殘留、菌群間的遷移、轉(zhuǎn)化和傳播,比抗生素殘留本身對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害更大[9-10]。針對(duì)這些問(wèn)題,Pruden等[11]2006年首次提出將抗生素抗性基因作為一類新型環(huán)境污染物。

四環(huán)素類抗生素由于其廣譜性和低毒性,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)以及養(yǎng)殖業(yè)。而近幾年,四環(huán)素耐藥細(xì)菌及抗性基因的不斷發(fā)現(xiàn)成為多個(gè)領(lǐng)域面臨的嚴(yán)重問(wèn)題[12]。細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類的抗性主要由兩種機(jī)制介導(dǎo)：一種是能量依賴性排出泵(energy dependent efflux pump),另一種是核糖體保護(hù)蛋白(ribosomal protection proteins,RPPs)[13]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了40多種四環(huán)素抗性基因,兩種機(jī)制的抗性基因大多可以通過(guò)可轉(zhuǎn)移的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子傳播,進(jìn)而滲透到各種需氧或厭氧的革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌中[14]。其中RPPs基因廣泛分布于地球多種環(huán)境介質(zhì)中,并且它們與生物蛋白質(zhì)合成過(guò)程中起重要作用的延長(zhǎng)因子,如EF-G(原核生物蛋白質(zhì)合成過(guò)程中催化 tRNA的移位和多肽延伸的每個(gè)循環(huán)后期mRNA從核糖體上掉下來(lái))/EF-2(參與真核生物蛋白質(zhì)合成,功能相當(dāng)于原核生物的EF-G)以及EF-Tu(介導(dǎo)氨酰-tRNA進(jìn)入核糖體的空位)/EF-1α(真核生物EF-1的α亞基,相當(dāng)于原核生物中的EF-Tu亞基)具有近緣關(guān)系[15-17]。通常抗性基因作為“附件”基因單位(“accessory” genes),一般位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等可動(dòng)遺傳因子上,他們與細(xì)菌自然環(huán)境下的成長(zhǎng)并沒(méi)有必然的聯(lián)系,而延長(zhǎng)因子是細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的基因,并且來(lái)自具有很長(zhǎng)進(jìn)化歷史的參與蛋白合成的GTPase家族[18]。鑒于 RPPs基因與延長(zhǎng)因子的特殊關(guān)系,對(duì)RPPs基因本質(zhì)的研究是了解該類抗性基因的抗藥性機(jī)制和傳播途徑的非常有效且直接的方法。

本研究關(guān)注的tet(M)基因就是一類重要的 RPPs基因,它通常和接合性轉(zhuǎn)座子Tn1545-Tn916相結(jié)合,而Tn1545-Tn916是一個(gè)廣宿主轉(zhuǎn)座子,它可以在多種細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移[14,19-20]。這使得tet(M)基因可以通過(guò)染色體垂直傳播或質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子水平傳播進(jìn)而在環(huán)境中廣泛傳播。研究顯示,tet(M)基因在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中分布廣泛,很有可能迅速在環(huán)境中造成抗性基因污染[21]。國(guó)外學(xué)者對(duì)不同環(huán)境介質(zhì)不同細(xì)菌寄主的tet(M) 基因進(jìn)行了研究,試圖從分子水平分析tet(M)基因的起源[22-25]。根據(jù)我們掌握的文獻(xiàn),目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)單獨(dú)對(duì)tet(M)基因的研究報(bào)道,只有從不同環(huán)境介質(zhì)檢測(cè)到tet(M)基因的存在[26]。為了研究不同來(lái)源的tet(M)基因與其環(huán)境介質(zhì)、細(xì)菌宿主的相關(guān)性,從DNA序列這一最本質(zhì)的層面揭示抗生素抗性基因的分化及潛在的傳播機(jī)制,本文采用分子系統(tǒng)學(xué)的方法針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中常見(jiàn)的四環(huán)素類抗生素抗性基因tet(M)的序列特點(diǎn)及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析,旨在為今后分析抗生素抗性基因來(lái)源、污染機(jī)理及控制對(duì)策奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖環(huán)境tet(M)基因數(shù)據(jù)獲取

從GenBank下載來(lái)自不同水產(chǎn)養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境的常見(jiàn)四環(huán)素類抗性基因tet(M)序列,基本信息包括抗性基因種類、細(xì)菌種屬、環(huán)境介質(zhì)及序列接受號(hào)Accession number列于表1。

表1 水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境檢出的tet(M)基因Tab.1 Detection of tet(M) genes in aquaculture environment

1.2 序列比對(duì)與系統(tǒng)學(xué)分析

將 20條序列用 Clustal W 軟件[32]比對(duì),DnaSP 4.0[33](DNA sequence Polymorphism)軟件進(jìn)行單倍型及多態(tài)性分析。采用MEGA 4.0[34](molecular evolution genetic analysis)軟件,用最大簡(jiǎn)約信息(Most Parsimony,MP)法和鄰近(Neibourgh Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。再應(yīng)用自展法(bootstrap)檢驗(yàn)樹(shù)的可靠性(500次重復(fù))。空位始終作為缺失狀態(tài),大腸桿菌延長(zhǎng)因子EF-Tu基因(Gi| 296507628：5254-6438)作為外源基因,并結(jié)合寄主細(xì)菌分類及環(huán)境介質(zhì)與tet(M)基因的系統(tǒng)發(fā)育作相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列多態(tài)性分析

序列比對(duì)得到662 bp同源片段,55個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。20條基因序列有 4種基因型(表 2),其中基因型tet(M)-a存在于來(lái)自澳大利亞養(yǎng)殖魚(yú)體內(nèi)分離的3種細(xì)菌,包括嗜水氣單胞菌兩個(gè)亞種及遲鈍愛(ài)德華菌Edwardsiella tarda; b基因型廣泛分布于多種細(xì)菌中,包括 B1、C1、C2、D1、E2、E4、E6、E7、F2、F3、F4 、B2共5種環(huán)境介質(zhì)12種細(xì)菌,其中B1、C1、C2、D1、E2等5種細(xì)菌均來(lái)自弧菌屬(Vibrio); c基因型只存在于1種鏈球菌中,且與d基因型具有很近的親緣關(guān)系,僅在405bp位點(diǎn)上有一個(gè)單堿基的A/G轉(zhuǎn)換; d基因型存在于4種細(xì)菌,包括2種芽孢桿菌F1、E5,一種弧菌E1,以及一種希瓦氏菌E3。4種基因型的平均核苷酸差異度為4.2%,最大值8.3%出現(xiàn)在b和c兩種基因型之間,最小值在c和d之間,為0.2%。

表2 tet(M)基因型核苷酸差異度及多態(tài)位點(diǎn)Tab.2 Nucleotide divergence and polymorphic sites in different tet(M) genotypes

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

最大簡(jiǎn)約樹(shù)顯示20條tet(M)序列清晰分成三大分支(圖 1),其中 Clade1對(duì)應(yīng)于tet(M)-a基因型,Clade2對(duì)應(yīng)于tet(M)-c和 d基因型,Clade3對(duì)應(yīng)于tet(M)-b,500次重復(fù)檢驗(yàn),枝上置信度均為100%。鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)與此樹(shù)形結(jié)構(gòu)相同,文中未列出。

圖1 水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境tet(M)基因分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(分支上數(shù)字為自展支持率)Fig.1 Molecular phylogenetic tree of tet(M) genes in Aquaculture environment (The numbers above the branches indicate bootstrap support of MP)

3 討論

從表1可以看出,水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中tet(M)基因存在于多種細(xì)菌中,從海水環(huán)境中常見(jiàn)的病原菌到一些環(huán)境細(xì)菌。有研究表明,日本東京海域 21%～96%四環(huán)素抗性細(xì)菌攜帶有tet(M)基因,越南湄公河養(yǎng)殖區(qū)及中國(guó)海洋生物養(yǎng)殖場(chǎng)也檢測(cè)到大量的tet(M)基因,暗示tet(M)基因是養(yǎng)殖環(huán)境細(xì)菌四環(huán)素抗性的主要機(jī)制[25,29,35]。tet(M)基因存在于細(xì)菌的可動(dòng)遺傳元件如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、接合轉(zhuǎn)座子以及整合子[14,22,36],這使得tet(M)基因能更容易從一個(gè)物種傳播到另一個(gè)物種[37],進(jìn)而導(dǎo)致其在環(huán)境中大量細(xì)菌內(nèi)的廣泛分布[15]。在中國(guó),長(zhǎng)期以來(lái)四環(huán)素類抗生素因其廣譜及低毒性,一直作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的常用藥,并作為添加劑低劑量加入餌料以促進(jìn)養(yǎng)殖生物的生長(zhǎng),使得養(yǎng)殖環(huán)境成為四環(huán)素類抗生素的重要潴留池。因此,tet(M)基因的環(huán)境毒理效應(yīng),應(yīng)作為中國(guó)養(yǎng)殖環(huán)境重要的關(guān)注對(duì)象。

基因序列多態(tài)性分析顯示(表2),20條水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中tet(M)基因共有4種基因型,其中,tet(M)-a基因型僅存于從澳大利亞養(yǎng)殖魚(yú)體分離的3種細(xì)菌中,其他3種基因型在各種介質(zhì)中均有出現(xiàn),暗示著a基因型具有一定的環(huán)境介質(zhì)特異性。相同的環(huán)境介質(zhì)代表著相同或近似的抗生素使用背景。研究發(fā)現(xiàn)抗生素抗性基因與抗生素的使用背景有著直接的關(guān)系,抗生素對(duì)耐藥菌株抗性基因的誘導(dǎo)具有專一性,因此,理論上抗生素本身在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化及歸趨等環(huán)境行為與其所誘導(dǎo)的抗生素抗性基因,在環(huán)境中的傳播應(yīng)該具有很大的相似性和一致性,抗生素的使用歷史與其抗性基因之間存在相關(guān)性[38-39]。日本科學(xué)家對(duì)太西洋遠(yuǎn)洋海域的抗性基因研究發(fā)現(xiàn),在大洋深處未被抗生素污染的區(qū)域,仍然檢測(cè)到了tet(M)抗性基因的存在[40]; Neela等[41]研究發(fā)現(xiàn),有些革蘭氏陽(yáng)性菌雖然攜帶tet(M)基因,但仍對(duì)四環(huán)素敏感,說(shuō)明tet(M)抗性基因的檢出頻率并不代表著抗性水平,還需要從基因表達(dá)的角度去分析。本研究中,大多數(shù)tet(M)的基因型與環(huán)境介質(zhì)并無(wú)直接關(guān)系,相同或相近的環(huán)境介質(zhì)內(nèi),tet(M)基因型可能相同或近緣(如A1、A2與A3),但也可能遠(yuǎn)緣(如D1與D2,F1與F2),說(shuō)明環(huán)境介質(zhì)與tet(M)基因型并無(wú)嚴(yán)格的相關(guān)性,暗示著tet(M)基因在環(huán)境中的迅速傳播及分化。根據(jù)前人報(bào)道,很多抗生素抗性基因其實(shí)在抗生素使用之前就已存在,Kobayashi等[42]的分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果更加證實(shí)了RPPs基因包括tet(M),早在地球上生物總界分化之前已經(jīng)存在,也就是說(shuō),RPPs在原核與真核生物分化之前就已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)化。從寄主細(xì)菌的分類地位角度看,水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中 4種基因型在細(xì)菌中分布沒(méi)有嚴(yán)格的種屬特異性(表2)。相同或相近的tet(M)基因型可以存在于近緣或相同的細(xì)菌中(如弧菌屬的5種細(xì)菌均攜帶tet(M)-b基因型),也可以存在于遠(yuǎn)緣的物種(如tet(M)-d同時(shí)存在于芽孢桿菌F1、E5,弧菌E1以及希瓦氏菌E33類細(xì)菌中)。同種或近緣的細(xì)菌應(yīng)該具有相同或類似的遺傳背景,而本研究中相同的遺傳背景包含不同的tet(M)等位基因或者相同的tet(M)在遠(yuǎn)源的細(xì)菌株系中發(fā)現(xiàn),進(jìn)一步顯示了tet(M)基因活躍的運(yùn)動(dòng)和進(jìn)化[23]。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上 20條基因序列分成了三大分支(圖 1),其中 Clade1對(duì)應(yīng)于tet(M)-a基因型,Clade2對(duì)應(yīng)于tet(M)-c和d基因型,Clade3對(duì)應(yīng)于tet(M)-b基因型。Rahman等[25]對(duì)日本近岸海域細(xì)菌抗性的研究,將海洋環(huán)境的tet(M)基因分成兩種類型：tet(M)-A和tet(M)-B,其中前者代表起源于前抗生素時(shí)代即存在的自然基因儲(chǔ)備(natural gene pool); 后者則代表通過(guò)選擇或水平基因轉(zhuǎn)移獲得的基因。三大支系中,Clade2包含的tet(M)-d基因型與tet(M)-A相同,clade3對(duì)應(yīng)的tet(M)-b則與tetM-B型相同,二者的平均核苷酸差異度達(dá)到8%; 這兩種基因型與前人研究結(jié)果相比,分別對(duì)應(yīng)于Agerso等[43]2006年所分的tet(M)-II和tet(M)-III,Gevers等[24]2003年所分的tet(M)-2和tet(M)-1,以及Huys等[44]2004年所分的type-I和type-V。Clade1對(duì)應(yīng)的tet(M)-a及Clade2中的tet(M)-c與tet(M)-d近緣,但已有一定的分化,核苷酸差異度分別為3.7%和0.2%。Oggioni研究顯示,tet(M)的基因變異是由于兩種遠(yuǎn)緣的等位基因的同源重組產(chǎn)生的,這兩種遠(yuǎn)緣等位基因類型分別發(fā)現(xiàn)于Tn1545和Staphylococcus aureus[45]。新的tet(M)基因型可能是由于前兩種等位基因重組形成的鑲嵌結(jié)構(gòu)(mosaic structure),進(jìn)而形成了介于兩類遠(yuǎn)緣等位基因之間的基因型[23,24,46]。由此本研究中,tet(M)-a與tet(M)-c應(yīng)為tet(M)-b和tet(M)-d兩種遠(yuǎn)緣基因型的中間類型。

綜上所述,tet(M)基因的分型與細(xì)菌的分類及環(huán)境介質(zhì)的來(lái)源并無(wú)嚴(yán)格的相關(guān)性,因此今后在研究此類基因的環(huán)境毒理效應(yīng)時(shí),不應(yīng)只分析基因的檢出率及抗生素背景,還應(yīng)從分子水平研究基因的變異及表達(dá)在不同細(xì)菌寄主及環(huán)境介質(zhì)中的變化,了解該類基因的抗性分化機(jī)制,以期從分子手段入手降低甚至消除其抗藥性或阻斷其傳播途徑。中國(guó)作為水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó),在生產(chǎn)過(guò)程中抗生素特別是四環(huán)素類抗生素濫用嚴(yán)重,抗藥細(xì)菌及抗生素抗性基因的增多將大大增加養(yǎng)殖業(yè)及人體耐藥病原菌病害發(fā)生和流行的可能性及危害程度。tet(M)基因是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)抗性基因,傳播及進(jìn)化活躍,廣泛分布于多種耐藥性病原菌及環(huán)境細(xì)菌中,因此,在今后的科研及環(huán)境保護(hù)過(guò)程中應(yīng)予以一定的重視。

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