李蓉，于長青

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶163319）

膽鹽水解酶(bile salt hydrolase，BSH)是由bsh基因編碼的一種胞內(nèi)酶[1-2]，是微生物在生長和繁殖過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，微酸環(huán)境下的最適pH值一般在5和6之間，對氧氣不敏感，該酶已經(jīng)從多種微生物中得到了分離和鑒定[3-4]。目前，發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)膽鹽水解酶的菌株都是革蘭氏陽性菌，其中包括部分的益生菌株，如：乳酸菌、雙歧桿菌等該酶主要由乳酸菌產(chǎn)生。BSH可能對膽固醇和氨基酸基團(tuán)(甘氨酸/?；屈S氨酸)都具有識別性，有文獻(xiàn)報(bào)道BSH酶能識別膽酸酯基團(tuán)。Moser和Savage[5]的研究發(fā)現(xiàn)JCM1069布氏乳桿菌表達(dá)?；撬崦撗跄懼崴饷傅槐磉_(dá)?；撬崮懼崴饷浮SH能水解結(jié)合態(tài)?；撬崮扄}和甘氨酸膽鹽，將其轉(zhuǎn)變成氨基酸和游離膽酸。

血清中高水平的膽固醇是誘發(fā)高血壓、冠心病等眾多心血管疾病的重要因素[6-7]，所以如何控制血清膽固醇水平已經(jīng)受到越來越廣泛的關(guān)注。藥物治療存在藥費(fèi)昂貴，毒副作用較大、治療效果不明顯等缺陷。目前，口服益生菌是研究的熱點(diǎn)，它的治療效果明顯，能夠顯著地降低血清膽固醇的含量，對高血脂的防治有積極的作用[8-9]。BSH酶能水解結(jié)合態(tài)?；撬崮扄}和甘氨酸膽鹽，轉(zhuǎn)變成氨基酸和游離膽酸，作用后產(chǎn)生的去結(jié)合型膽鹽比結(jié)合型膽鹽重吸收效率低，致使大量的去結(jié)合型膽鹽從糞便中排出。去結(jié)合型膽鹽的大量流失使得體內(nèi)需要消耗更多的膽固醇重新合成膽酸鹽來彌補(bǔ)損失，從而逐步使血清膽固醇水平降低[10-11]去結(jié)合膽鹽能夠降低血清中膽固醇的含量，主要通過以下兩個(gè)途徑：一是通過合成膽酸來補(bǔ)充那些隨糞便排出的膽酸來增加膽固醇的需求量；二是降低了膽固醇的溶解度，減少了腸腔對膽固醇的吸收，使膽固醇與脫結(jié)合膽鹽一同沉淀下來。

BSH是絕大部分乳桿菌和大量益生菌產(chǎn)生的胞內(nèi)酶，目前有關(guān)膽鹽水解酶的研究報(bào)道相對較少，國內(nèi)的研究主要集中在降膽固醇機(jī)理、高產(chǎn)BSH酶優(yōu)良菌株的篩選、BSH酶的純化等方面；而國外也則正在進(jìn)行有關(guān)BSH酶微生物分子生物學(xué)等方面的研究，但還至今未見有突破性進(jìn)展。研究主要將植物乳桿菌中的BSH結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行克隆，為BSH基因的功能及基因工程的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 菌種及質(zhì)粒

植物乳桿菌Lp M1-UVS29、E.coliDH5α由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院保存；pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試劑

DNA Ladder 2000、rTaqDNA聚合酶、NcoⅠ和Hind III等限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA凝膠回收純化試劑盒均購自博大泰克公司；瓊脂粉、瓊脂糖、氨卞青霉素（Amp）、胰蛋白胨、酵母提取物等購自上海生工公司；SDS購于Sigma公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照Genbank中已報(bào)道的膽鹽水解酶全長基因序列（EU477374），利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)了一對擴(kuò)增BSH酶編碼區(qū)序列的特異性引物，引入酶切位點(diǎn)Hind III/NcoI，引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物：5'AAT CCA TGG ATG TGT ACT GCC ATA ACT TAT C 3'；下游引物：5'AAT GAG CTC TAT TAG TTA ACTGCA TAG TAT TGTG 3'。

1.4 BSH基因的PCR擴(kuò)增

采用CTAB法[12]提取植物乳桿菌基因組DNA，以DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增BSH結(jié)構(gòu)基因，PCR反應(yīng)體系為2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTPs，1μL模板DNA，上下游引物分別為0.5μL，0.2μL TaqDNA聚合酶，最后加ddH2O至終體積為25μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性50 s，48℃退火50 s，72℃延伸1 min，經(jīng)過30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10min[12]。

1.5 目的基因的克隆及測序

利用凝膠回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接，16℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliDH5α，37°培養(yǎng)12～16 h。經(jīng)藍(lán)白篩選獲得陽性重組子命名為pMD18-BSH；進(jìn)行質(zhì)粒小量提取，經(jīng)PCR（反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上）以及雙酶切鑒定，篩選陽性重組子，最后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行測序，將獲得DNA序列與Genbank數(shù)據(jù)庫中公布的已知功能基因進(jìn)行序列同源性比較以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增BSH結(jié)構(gòu)基因

取5μL PCR擴(kuò)增BSH結(jié)構(gòu)基因的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在接近1 000 bp處可見特異性目的條帶，見圖1。

圖1 BSH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR productof BSH gene

2.2 重組克隆質(zhì)粒的鑒定

重組克隆質(zhì)粒pMD18-BSH的PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在接近1 000 bp處可見特異性目的基因條帶，見圖2。

圖2 重組克隆質(zhì)粒pMD-BSH的PCR鑒定Fig.2 The PCR identity of pMD18-/BSH clone vector

圖3 重組克隆質(zhì)粒pMD-BSH的酶切鑒定M：DL2000：標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：pMD18-BSH；2：pMD18-BSH（BamH I/Sal I）Fig.3 Restrictionmap of recombinant plasmid pMD18-BSH

2.3 測序比對結(jié)果

使用DNAMAN軟件，將測序的核苷酸序列與Genebank已公布的序列（EU477374）進(jìn)行比對，結(jié)果顯示兩者同源性高達(dá)99.3%。由于菌株的特異性和遺傳密碼子的簡并性，所以核苷酸序列有個(gè)別差異。見圖4。

3 結(jié)論

研究采用PCR技術(shù)從植物乳桿菌Lp M1-UVS29基因組中得到了BSH基因片段，通過克隆、測序，得到其核苷酸序列，為995 bp。對其核苷酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)BSH基因的核苷酸序列與Genbank(EU477374)有較高的同源性。同源性高達(dá)99.3%，證明成功克隆了BSH結(jié)構(gòu)基因。

圖4 測序的核苷酸序列與Genebank（EU477374）比對Fig.4 The comparison between the predicted amino acid sequence and the EU477374

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