陳斌,徐細建,李馨
(黑龍江八一農墾大學動物科技學院,大慶163319)
人轉化生長因子β1(TGF-β1)全基因約為100 kb,由8個外顯子和7個內含子組成,翻譯后產物為390個氨基酸。TGF-β1是轉化生長因子家族的重要成員,具有促進細胞增殖分化的作用,對骨細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調節(jié)作用。另外TGF-β1對細胞外基質的形成、腫瘤發(fā)生和免疫系統(tǒng)方面具有重要的調節(jié)作用[1-2]。
功能基因的克隆測序和定位已成為動物遺傳育種研究的熱點之一。但是,目前對于鹿科動物TGF-β1基因方面的報道卻很少,在網上也只公布了牛的TGF-β1基因全序列和羊的外顯子序列。研究利用牛TGF-β1基因全序列和羊的7、8外顯子序列設計了特異性引物,對梅花鹿TGF-β1基因部分片段進行了克隆測序分析,旨在為梅花鹿的遺傳育種提供理論依據。
在黑龍江省興凱湖鹿場隨機選取6頭健康公鹿,頸靜脈采血,置于含有ACD抗凝劑的1.5mL離心管中,于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
DNA凝膠回收試劑盒、小劑量快速質粒DNA提取試劑盒購自Omega公司,rTaq聚合酶、限制性內切酶購自大連寶生物工程有限公司,pMD18-T Vector購自Takara公司。
梅花鹿基因組DNA按照《分子克隆實驗指南》[3]方法提取,并溶于TE中,-20℃保存。用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法雙重檢測DNA的純度和濃度,稀釋備用。
由于GenBank中不能查到關于鹿的TGF-β1基因的全序列,因此根據與鹿科動物比較相近的牛(NC_007316)的TGF-β1基因全序列和羊(X76916)TGF-β1基因部分序列進行序列比對后,使用oligo6.22軟件跨7、8外顯子設計1對引物,擴增片段長度為839bp。引物序列如下:
F:(5’-3’)GACCTGGGCTGGAAGTGGA;
R:(5’-3’)CCGGGTTGTGCTGGTTGTA。
擴增體系組成:共25μL體系,其中包括:滅菌去離子水 16.75μL,DNA模板 2.0μL,10×buffer 2.5μL,2.5 mmoL·L-1的dNTP 2.5μL,10p moL·L-1的上下游引物各0.5μL,0.5 U/μL的rTaq酶0.25μL。
引物的擴增反應循環(huán)參數:95.0℃預變性5min;之后30個循環(huán):95.0℃變性30 s,63.8℃復性40 s,72.0℃延伸40 s;最后72.0℃延伸10min。
取50μL PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后,把含有目的條帶的膠割下,用凝膠回收試劑盒純化回收。取回收產物4.5μL加入到0.5μL pMD18-T Vector載體中,然后加入Ligation SolutionⅠ5μL混勻,在16℃的水浴鍋中連接12 h。將10μL連接產物轉化到150μL的DH5α感受態(tài)宿主菌中,取100μL轉化產物涂在含氨芐(質量濃度100μg·mL-1)的LB平板上,挑取經PCR鑒定后的陽性白色菌斑培養(yǎng)。用試劑盒抽提質粒,經酶切鑒定后送上海英駿公司進行測序。測定的結果與其它哺乳動物的TGF-β1基因序列進行比較。
從鹿茸血中分離得到總DNA,通過PCR方法獲得了大小為839 bp的DNA片段。電泳結果見圖1。
將目的片段連接到pMD-18T載體上,通過藍白斑篩選,分別通過PCR鑒定和雙酶切(EcoRI和HindⅢ)鑒定,結果證實已得到正確的克隆。電泳結果分別見圖2、圖3。
圖1 引物PCR擴增結果Fig.1 Amplifying resultof PCR注:M為marker(DL2000),1-4為PCR擴增產物
圖2 陽性克隆質粒的PCR鑒定Fig.2.Identification of PCR positive cloning plasmid注:M為marker(DL2000),1-8為質粒PCR產物
圖3 陽性克隆質粒的酶切鑒定Fig.3.Identification of Positive cloning plasmid enzymes cut注:M為marker(DL2000),1為對照,2為質粒酶切產物
經上海英駿公司測定,梅花鹿TGF-β1基因部分序列的長度為839 bp,包括2個外顯子的部分序列和1個內含子的全序列。該結果已被提交到GenBank上。
將所測序列通過GenBank中的Blast比較分析,表明梅花鹿TGF-β1基因與牛的同源性為92%,與羊的同源性為94%。
TGF-β1是具有多種生物學功能的細胞因子,廣泛存在于正常組織、細胞和轉化細胞中。TGF-β1基因的表達在轉錄、翻譯和釋放環(huán)節(jié)存在調節(jié)功能基因的作用[4]。TGF-β1在骨組織中含量較為豐富,在骨形成和重建過程中起到協(xié)調間充質細胞、成骨細胞和破骨細胞活動的重要作用。TGF-β1可以顯著提高軟骨細胞表型,促進培養(yǎng)軟骨細胞表達Ⅱ型膠原和蛋白多糖,誘導間充質細胞化為軟骨細胞[5]。Tanaka等將TGF-β1作用于大鼠顱骨骨膜后發(fā)現,增殖的主要細胞是前成骨細胞并可誘導發(fā)生膜內化骨,加速骨的生長[6]。TGF-β1還可抑制骨髓培養(yǎng)中破骨細胞的形成及其活性,從而抑制骨吸收[7]。鹿茸角再生發(fā)育后,間充質細胞、前軟骨細胞、軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞進行分化和增殖,各層組織的細胞也相互轉化,處在一個動態(tài)的平衡中,維持著鹿茸的成長發(fā)育[8]。有研究表明[9],TGF-β家族mRNA在梅花鹿茸角中表達,在刺激皮膚表皮基層細胞與真皮成纖維細胞的增值、促進軟骨膜及間充質細胞向軟骨細胞分化、維持鹿茸軟骨細胞的快速增殖及抑制過早骨化等過程中起重要的調節(jié)作用。那么,在梅花鹿的選育中,通過研究TGF-β1基因并探討TGF-β1基因多態(tài)性與鹿茸生長性能的關系,達到提高鹿茸產量的目的,也將成為我們關注的另一重要研究內容。
梅花鹿作為主要的茸用鹿種,其應用前景是非常廣闊的。盡管目前其選育水平還只停留在人工選育階段,但是已經開始研究利用分子標記對梅花鹿進行標記輔助選擇。杜智恒等[10-11]對梅花鹿GH基因和IGF I基因分別進行了克隆測序,為梅花鹿產茸性狀的研究提供了理論數據。研究利用PCR技術,對梅花鹿的TGF-β1基因進行了克隆測序,并且將該序列提交到了GenBank上。通過序列比較,梅花鹿與牛、羊之間同源性均高于90%,這說明TGF-β1基因在物種進化過程中保守性很高,在動物生命活動中起到很重要的作用。
試驗只是對TGF-β1基因進行了初步的探索,期望能夠獲得梅花鹿TGF-β1基因的全序列,并進一步開展該基因多態(tài)性與產茸性狀的相關性研究。
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