溫麗娟，王桂華，侯喜林，余麗蕓，，王萌

（1.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶163319；2.黑龍江八一農墾大學動物科技學院）

產腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起仔豬腹瀉疾病的主要病原菌之一[1-3]，給我國乃至全世界畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失。疫苗接種是預防該病的主要措施[4]，目前，國內外使用的接種疫苗主要有滅活疫苗和弱毒疫苗，但滅活疫苗免疫原性差，而弱毒疫苗存在接種后動物機體排散病毒、病毒毒力返強等缺陷。針對ETEC主要經消化道和呼吸道黏膜感染的特點，研制能有效的刺激黏膜免疫系統(tǒng)產生局部免疫應答，進一步引起全身性系統(tǒng)免疫反應的新型疫苗，對該病的防治具有重要意義。

乳酸菌是人和大多數(shù)動物腸道內的常見細菌，被公認為安全級（generally recognized as safe，GRAS）微生物[5]，具有免疫佐劑、吸附黏膜、抗膽汁酸等能力，而且乳酸菌本身又具有低免疫原性，因此，以乳酸菌為載體作為外源基因的傳遞和表達系統(tǒng)研制口服疫苗，具有重要開發(fā)前景[6-12]。本研究選擇能在腸道中定植的食品級微生物干酪乳桿菌作為遞呈抗原物質的載體，采用一種新型的表面展示系統(tǒng)，利用多聚谷氨酸跨膜蛋白pgsA的錨定機制[13-15]，構建了表達K99-K88-LTB融合蛋白的重組干酪乳桿菌表達系統(tǒng)，并通過Western blot、間接免疫熒光技術及流式細胞術對表達于菌體表面的融合蛋白進行了鑒定。

1 材料和方法

1.1 菌株和質粒

產腸毒素性大腸桿菌標準菌株C83912由黑龍江八一農墾大學基因工程實驗室保存；大腸桿菌pQEK88-LTB由黑龍江八一農墾大學預防獸醫(yī)學實驗室贈送；干酪乳桿菌表面表達載體pHCE1LB-pgsA（pLA）由黑龍江八一農墾大學基因工程實驗室構建并保存；干酪乳桿菌CICC6105（Lactobacillus casei CICC6105）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 主要儀器和試劑

PCR儀、電穿孔儀，美國BIO-RAD公司；熒光顯微鏡，德國 Lecia公司；流式細胞儀，法國 BECTON DICKINSON公司；Taq DNA聚合酶、Bam HⅠ、SalⅠ、Hin dⅢ等限制性內切酶及T4DNA連接酶購自大連寶生物工程有限公司；小量DNA質粒提取試劑盒、小量瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒購自TIANGEN公司；MRS培養(yǎng)基購自Sigma公司；HRP標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG抗體購自Sigma公司；FITC標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術公司；其它生化試劑均為國產分析純產品。

1.3 引物

上游引物P1含Bam HⅠ酶切位點，下游引物P2含SalⅠ酶切位點，用于擴增K99基因，擴增的目的片段大小約498 bp；上游引物P3含SalⅠ酶切位點，下游引物P4含Hin dⅢ酶切位點，用于擴增K88ac-LTB基因片段，擴增的目的片段大小約825 bp；引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

1.4 重組質粒的構建

以標準菌株C83 912和重組菌pQE-K88ac-LTB為模板，利用各自設計的引物PCR擴增，分別獲得K99基因片段和K88 ac-LTB基因片段，然后將純化得到的基因片段連接到穿梭載體pHCE1LB-pgsA（pLA）[16]得到重組質粒命名為pLA-K99-K88 ac-LTB。按照Aymerich等[17]方法制備L.casei感受態(tài)細胞，將重組質粒及空載體質粒pLA在2.0 kV·cm-1、100Ω、25μF的電擊條件下轉化，電擊時間約為4.5ms。電轉化結束后，將轉化子涂布于MRS固體培養(yǎng)基（含氯霉素34μg·mL-1），37℃厭氧培養(yǎng)24 h，挑選陽性菌落，按照Ian B.Powell等[18]方法從乳酸桿菌中提取質粒DNA，PCR鑒定陽性重組菌。

1.5 目的蛋白在干酪乳桿菌中的誘導表達及鑒定

將重組菌 pLA-K99-K88 ac-LTB/L.casei、pLA/L.casei接種于MRS液體培養(yǎng)基（含氯霉素34μg·mL-1）中，以pLA/L.casei為對照，37℃靜置過夜活化，次日，分別按2%接種于10 mLMRS培養(yǎng)基中進行誘導表達。誘導表達6 h后，4 000 r·min-1離心5 min，收集沉淀；然后，菌體沉淀用400μL 10 mg·mL-1的溶菌酶 37℃水浴作用 40 min，4 000 r·min-1離心5min，棄上清，加入SDS-PAGE樣品緩沖液，混勻，沸水浴10 min，12 000 r·min-1離心5 min，以蛋白質標準分子量為參考，取上清15μL，以10%的SDS-PAGE進行電泳。SDS-PAGE電泳結束后，將凝膠中蛋白轉印到硝酸纖維素膜上，分別以ETEC K99、K88多抗血清作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗；以pgsA多抗血清為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，DAB底物顯色溶液中顯色15 min，觀察結果。

通過間接免疫熒光和流式細胞術檢測目的蛋白在干酪乳桿菌表面的錨定[19]。

間接免疫熒光檢測：取表達6 h后的陽性重組菌和空菌1mL，離心去上清后，PBS洗滌3次，重懸于PBS中，取適量涂片，冷無水乙醇固定30min，5%脫脂乳4℃過夜封閉，次日，PBST洗3次，于被檢標本上分別滴加兔源抗pgsA多抗血清，置于濕盒中，4℃作用6～8 h，PBST洗3次，滴加FITC標記的熒光二抗（1∶100稀釋），置于濕盒中，4℃（避光）作用過夜，PBST洗3次，最后用蒸餾水洗1次，甘油緩沖液封片后鏡檢。

流式細胞術檢測：取表達6 h后的陽性重組菌和乳酸菌空菌0.5mL，用300目篩網過濾，4℃，4 000 r/min離心5 min，收集菌體，PBS洗3次，重懸于PBS中，調節(jié)菌體數(shù)達5×107-5×108CFU/mL，4℃，5%脫脂乳過夜封閉；次日，PBST洗3次，加入兔源抗pgsA多抗血清，4℃作用6～8 h，PBST洗3次，加入FITC標記的熒光二抗（1∶100稀釋），4℃過夜作用；次日，PBST洗3次，重懸于PBS中在流式細胞儀上檢測。

2 結果

2.1 K 99、K 88-LTB基因PCR擴增結果

以制備的染色體DNA和質粒DNA為模板，通過設計的特異性引物進行PCR擴增。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1條約498 bp的特異性條帶和1條約825 bp的特異性條帶（見圖1 A、B），與預期DNA片段大小一致。

圖1 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 1%Agarose gel electrophoresis of PCR product

2.2 重組質粒的酶切鑒定結果

重組質粒經Bam HⅠ/SalⅠ、SalⅠ/Hin dⅢ、Bam HⅠ/HindⅢ雙酶切，結果切出大小約為7 171 bp和498 bp、6 844 bp和825 bp、6 346 bp和1 323 bp等片段，與預期結果相符，篩選出陽性重組子pLA-K99-K88-LTB（見圖2）。

2.3 PCR擴增干酪乳桿菌轉化子的結果

以干酪乳桿菌轉化子為模板，通過設計的ETEC K99、K88-LTB和枯草芽孢桿菌pgsA特異性引物進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約498 bp、825 bp和1 116 bp等3條特異性條帶，與預期DNA片段大小一致結果（見圖3）。

圖2 重組質粒pLA-K 99-K 88-LTB的酶切鑒定Fig.2 Identification ofpLA-K99-K88-LTB by enzyme digestion

圖3 重組質粒PCR鑒定結果Fig.3 Identification of recombinant plasmid by PCR

2.4 目的蛋白在干酪乳桿菌中的誘導表達及鑒定

2.4.1 重組蛋白的Western blot鑒定

重組菌表達產物經SDS-PAGE電泳后，轉移到PVDF膜上，分別與鼠源抗K99（圖4A）、K88（圖4B）多抗血清作用，再經羊抗鼠IgG/HRP二抗作用，Western blot分析結果顯示：在預期位置出現(xiàn)明顯的條帶（約90 kDa），與預計大小一致；而含空質粒pLA對照未見此目的條帶，說明表達的蛋白可被鼠源抗K99、K88多抗血清所識別。

重組菌表達產物經SDS-PAGE電泳和PVDF膜轉印后，與兔源抗pgsA（圖4C）多抗血清作用，再經羊抗兔IgG/HRP二抗作用，Western blot分析結果顯示：在預期位置出現(xiàn)明顯的條帶（約90 kDa），與預計大小一致；而含空質粒pLA對照可見其標簽蛋白（約43 kDa），而未見此目的條帶，說明表達的蛋白可被兔源抗pgsA多抗血清所識別。

圖4 重組蛋白的anti-K 99（A）、anti-K 88（B）、anti-pgsA（C）W estern blot檢測結果Fig.4 Western blotanalysis of the recombinant protein using anti-K99（A），anti-K88（B），anti-pgsA（C）antibody.M.

2.4.2 間接免疫熒光和流式細胞術鑒定

以L.casei為對照，與重組菌pLA-K99-K88 ac-LTB/L.casei共同進行間接免疫熒光實驗，以兔源抗pgsA多抗血清（圖5）為一抗，以羊抗兔IgG/FITC為二抗，試驗結果表明：實驗組可見明顯的綠色熒光（圖5A），對照組未見綠色熒光（圖5B），明視野下可見與熒光視野下相同的細菌形態(tài)，由此表明，重組干酪乳桿菌表達了外源融合蛋白，初步表明表達的重組蛋白錨定于菌體表面。

圖6 流式細胞術檢測重組蛋白Fig.6 Fluorescence-activated cell sorter histograms of L.casei（open）and of the recombinant L.casei cells（filled）.The cellswere probed with rabbitanti-pgsA polyclonal antibodies，followed by FITC-anti-rabbit IgG antibody and fluorescein isothiocyanate-conjugated streptavidin.

以乳酸菌L.casei為對照，與重組菌pLA-K99-K88 ac-LTB/L.casei進行流式細胞術分析。試驗結果表明（圖6）：重組菌pLA-K99-K88 ac-LTB/L.casei的熒光信號強度明顯高于乳酸菌空菌，結果與間接免疫熒光檢測結果相符，進一步證明外源重組蛋白在干酪乳桿菌表面表達。

3 討論

產腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）是引起仔豬腹瀉的主要致病菌，給我國乃至全世界的畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了極大的危害，造成了巨大的經濟損失。引起ETEC腹瀉的主要致病因子和保護性抗原是黏附素（又稱定居因子抗原）和腸毒素。ETEC感染宿主后，通過菌毛上的定居因子黏附于仔豬小腸上皮細胞，與上皮細胞的受體相結合，在小腸上皮細胞定植并大量繁殖，產生腸毒素，引起小腸上皮細胞代謝紊亂，最終導致腹瀉而使仔豬致病。因此，黏附素與上皮細胞上的受體相結合是引起仔豬腹瀉的前提條件[16，20]。引起仔豬腹瀉的菌毛抗原主要有K88、K99、987P及F41，其中以K88菌毛抗原型的ETEC在我國流行性最廣，K99次之。

對于ETEC的感染，目前對該病的防治多以藥物和疫苗為主，但藥物治療價格昂貴，且耐藥菌株日趨增多，因此疫苗預防是控制該病感染的最佳選擇[4]。雖然國內外已有多種預防幼畜腹瀉的滅活菌體疫苗，但滅活疫苗僅能誘發(fā)體液免疫應答，不能誘導細胞免疫和局部黏膜免疫應答，而且對后代主動免疫會產生嚴重干擾[21]，而弱毒活疫苗存在排散病毒、病毒毒力返強等不安全因素。針對ETEC主要經消化道和呼吸道黏膜感染的特點，研制能有效地刺激黏膜免疫系統(tǒng)產生局部免疫應答，進一步引起全身性系統(tǒng)免疫反應的疫苗，對該病的防治具有重要意義。

以細菌、病毒作為活載體均可達到這一目的，但從生物安全性及疫苗免疫效果角度出發(fā)，能在腸道黏膜定植的乳酸菌被認為是最合適的載體系統(tǒng)。

干酪乳桿菌是定植于人及動物腸道黏膜表面的重要益生菌群之一，具有免疫佐劑、吸附黏膜、抗膽汁酸能力，而其本身又具有低免疫原性。因此，以干酪乳桿菌為載體，作為外源基因的傳遞和表達系統(tǒng)，研制口服疫苗，具有重要開發(fā)前景。

研究以食品級干酪乳桿菌CICC 6105作為遞送疫苗抗原的活菌載體，利用能夠在大腸桿菌和乳酸菌之間穿梭的表面表達載體pLA，構建了細胞表面表達ETEC K99、K88融合蛋白的重組干酪乳桿菌系統(tǒng)，以期利用該重組菌作為ETEC口服疫苗，達到同時預防ETEC細菌感染的目的。對構建的重組干酪乳桿菌表達的融合蛋白經Western blot免疫學檢測分析，外源重組蛋白能夠被陽性血清所識別，表明所構建的重組干酪乳桿菌表達系統(tǒng)能夠有效的表達外源目的蛋白，重組蛋白與天然抗原一樣具有相同的免疫原性。目前普遍認為，在宿主細胞表面表達外源抗原是活載體疫苗向黏膜免疫系統(tǒng)提呈抗原的最佳方式。研究所使用pLA表達載體是一種基于枯草芽孢桿菌pgsA的新型細胞表面表達系統(tǒng)，在此系統(tǒng)中，目的蛋白的N端可以和pgsA相連，進而使融合蛋白高效地表達在細胞表面。重組菌誘導表達后經間接免疫熒光和流式細胞術鑒定，結果表明重組菌表達的融合蛋白能夠表達于菌體的表面。

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