金甲正，符亞原，黃大鵬，張虎

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶163319）

豬生長激素（porcine Growth hormone，pGH）是由豬腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞合成分泌的單鏈多肽類激素。Thomsen用原位雜交法和輻射雜種板將pGH基因座定位在12號染色體短臂1區(qū)1帶[1]。Yerle等人用高分辨率G帶染色體原位雜交將pGH基因定位于12 p1.2-p1.5區(qū)域上[2]。pGH基因的全基因序列首先由Vizer等人確定[3]，該基因全長2 231 bp，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。近年來，國內(nèi)外的科研工作者已經(jīng)對pGH基因的結(jié)構(gòu)做了大量的工作，但pGH基因研究的主要工作仍集中在多態(tài)位點(diǎn)的尋找，且研究的區(qū)域主要集中在5＇端至外顯子3起始處[4-6]，而且在三江白豬種群中的多態(tài)性研究尚未見報道。本試驗采用PCR-RFLP技術(shù)檢測三江白豬群體中pGH基因第2外顯子的多態(tài)性，為今后研究瘦肉型豬種的基因型特征與生長性能的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品來源于黑龍江省大慶市三江白豬原種豬場，健康仔豬共121頭。取尾組織洗凈置于滅菌的EP管中，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取

取1 g左右的組織剪碎放入1.5mL的EP管中，加入2.5mL裂解液和5μL蛋白酶K，置于50℃水浴消化過夜。12 000 rpm，離心10min，取上清液，用等體積的混合酚和氯仿各抽提一次，用等體積的異丙醇沉淀DNA，再用70%的乙醇洗脫2次，最后用核酸真空干燥器烘干，加入150μL TE（pH=8.0）溶解過夜，-20℃保存。

1.2.2 引物及PCR

參照 GenBank中公布的 pGH基因序列（EU 684 437），用Primer 5.0軟件設(shè)計PCR引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物：5＇-GGAAGGAGAAGGGACAGGG-3＇；下游引物：5＇-TGGCAAATAGGCTGGACAA-3＇。

PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 3.00μL；dNTP 2.00μL；上游引物 0.50μL；下游引物0.50μL；模板DNA 1.00μL；DNA Taq酶0.25μL；加水至25.00μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min;94℃變性30 s，56℃，退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。取2μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并在60-250 CE型凝膠成像系統(tǒng)上觀察擴(kuò)增效果和照相。

1.2.3 酶切體系及反應(yīng)條件

酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物1μL，buffer 2μL，BSA 0.2μL，DdeⅠ酶0.5μL，加水至20μL。酶切反應(yīng)條件：在SHP-250型恒溫生化培養(yǎng)箱中37℃反應(yīng)4 h。取5μL酶切產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠，在200 V條件下進(jìn)行電泳檢測，并在60-250 CE型凝膠成像系統(tǒng)上觀察酶切效果、多態(tài)性和照相。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

1.3.1 群體等位基因和基因型頻率

Pi為第i個等位基因的頻率；i純合復(fù)等位基因；j1、j2、……jn為與i共顯的第1個到第n個等位基因。

Pij=（ij）/N

Pij為基因型頻率；ij為基因型個體；N為群體總數(shù)。

1.3.2 群體基因平衡狀態(tài)的檢驗

基因平衡的檢測：根據(jù)基因平衡定律，即哈代-溫伯格定律檢測基因平衡。在一個無窮大的或者足夠大的，且完全隨機(jī)交配的群體內(nèi)，如果沒有其他因素干擾時，則基因頻率和基因型頻率保持穩(wěn)定不變。遺傳平衡檢驗的卡方檢驗公式為：

Oi為實(shí)際觀察值；Ei為理論值；n為等位基因數(shù)。

1.3.3 三江白豬GH基因多態(tài)位點(diǎn)對生產(chǎn)性能的影響分析

利用SAS軟件包（Version 9.0）統(tǒng)計軟件中的GLM程序進(jìn)行單因素方差分析，分析突變位點(diǎn)基因型對初生重的影響。統(tǒng)計分析模型為：

式中，Yijk表示各性狀表型值，μ表示總體平均值，Gj為第j種基因型效應(yīng)，bij為初生重的回歸系數(shù)，X為初生重，Eijk為隨機(jī)誤差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGH基因外顯子2的PCR擴(kuò)增結(jié)果

擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上可觀察到電泳圖譜（如圖1）。結(jié)果顯示，與DL-2 000 DNA Marker比對，目的片段（183 bp）與擴(kuò)增片段大小一致且特異性良好。

圖1 pGH-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoretic pattern of PCR products of pGH gene

2.2 pGH基因外顯子2的PCR-RFLP結(jié)果

酶切產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示，DdeⅠ酶切后產(chǎn)生3種基因型（如圖2）。M泳道是DNA Marker-DL2 000；泳道1、2為AA型，片段大小為140 bp，43 bp；泳道3、4為BB型，片段大小為183 bp，43 bp；泳道5為AB型，片段大小為183 bp，140 bp，43 bp。

圖2 三江白豬GH基DdeⅠ酶切電泳圖譜Fig.2 The pattern of PCR-Dde I-RFLP of the second extron of pGH gene

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2.3.1 pGH基因外顯子2 DdeⅠ多態(tài)位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率

根據(jù)上述的基因頻率和基因型頻率計算公式，計算結(jié)果見表1。

表1 pGH外顯子2 DdeⅠ多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率Table 1 Genotypes distribution and alleles frequency of PCR-DdeⅠ-RFLP

經(jīng)卡方檢驗表明，三江白豬GH基因外顯子2 DdeⅠ酶切多態(tài)位點(diǎn)的x2值為1.61，顯示此多態(tài)位點(diǎn)在三江白豬群體內(nèi)分布差異不顯著（P＞0.05），處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。

2.3.2 三江白豬GH基因DdeⅠ多態(tài)位點(diǎn)對初生重的影響

采用一般線性模型分析三江白豬GH基因外顯子2的DdeⅠ酶切多態(tài)位點(diǎn)對初生重的影響（見表2）。

表2 pGH外顯子2 DdeⅠ酶切多態(tài)位點(diǎn)對仔豬初生重的影響Table 2 The effectof PCR-DdeⅠ-RFLP polymorphism to the birth weight

由表2可知，AB基因型的仔豬初生重顯著高于AA、BB基因型的仔豬（P＜0.05），而AA基因型和BB基因型的仔豬之間差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

生長激素的生物學(xué)功能主要是促進(jìn)肌肉的生長、核酸和蛋白質(zhì)的合成、脂肪的分解、提高機(jī)體免疫力等。有相關(guān)研究表明，生長激素可以直接刺激葡萄糖進(jìn)入肌肉細(xì)胞中，加速蛋白質(zhì)的合成，增加肌肉重量以及蛋白質(zhì)的沉積，使能量由脂肪組織向肌肉組織中轉(zhuǎn)移。Skarp Hedinesson等研究認(rèn)為，生長激素能夠使蛋白質(zhì)合成速度加快而不影響蛋白質(zhì)降解[7]。Matteri等證實(shí)，生長激素能夠提高氨基酸合成蛋白質(zhì)的速度，并且能降低氨基酸的氧化分解的速度[8]。在生長激素作用下，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)代謝總量減少，合成量大于降解量，從而提高了蛋白質(zhì)的沉積量。

試驗結(jié)果顯示，酶切后檢測到一處酶切突變位點(diǎn)，產(chǎn)生等位基因A（183 bp，43 bp）和B（143 bp，43 bp），其中等位基因A的基因頻率為0.55，等位基因B的基因頻率為0.45，在三江白豬群體中，A表現(xiàn)為優(yōu)勢基因；產(chǎn)生三種基因型，基因型頻率的大小依次為AB型（0.44），AA型（0.33），BB型（0.23），其中優(yōu)勢基因型為AB。對于三江白豬GH基因外顯子2 DdeⅠ酶切多態(tài)位點(diǎn)，AB型的仔豬初生重要略高于AA型和BB型的仔豬（P＜0.05），而AA型和BB型的仔豬之間沒有顯著性的差異（P＞0.05）。WANG Wen-Jun等[9]分析了南昌白豬和大約克夏豬pGH基因的不同基因型對仔豬初生重的影響，結(jié)果表明對仔豬初生重有一定的影響，但未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。劉海鋒等[10]用PCR-RFLP技術(shù)分析了約克夏和長白豬pGH基因不同基因型與生長性狀的關(guān)系，得到各種基因型均對70日齡重、120日齡重、70～120日齡日增重、70～120日齡料肉比等9個生產(chǎn)性狀無顯著影響；這些與本研究的結(jié)果不盡一致，這可能與研究的豬群品種不同有關(guān)，也可能與研究的多態(tài)位點(diǎn)不同有關(guān)。顏瑛等[11]對5個藏豬群體的ApaⅠ多態(tài)位點(diǎn)的檢測結(jié)果表明：除理塘藏豬，A等位基因在藏豬中表現(xiàn)為優(yōu)勢基因，其頻率大于0.6。黃大鵬等[12]對三江白豬H-FABP基因HaeⅢ酶切位點(diǎn)的多態(tài)性檢測表明：DD基因型同dd基因型和Dd基因型有顯著的差異。這些與本試驗的研究結(jié)果基本一致。

4 小結(jié)

通過PCR-RFLP方法研究分析了三江白豬GH基因外顯子2 DdeⅠ酶切位點(diǎn)不同基因型對仔豬初生重的影響，AB型仔豬初生重略高于AA型和BB型的仔豬，這體現(xiàn)出了基因的雜合效應(yīng)。但仍需加大樣本量進(jìn)一步分析驗證試驗結(jié)果。

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