侯美如，侯喜林，高俊峰，劉振格，王杰，楊明發(fā)

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319）

牛輪狀病毒是引起犢牛腹瀉的重要病原之一[1]。本病主要感染1～7日齡的犢牛，可引起犢牛消化道機(jī)能紊亂，臨床上以嘔吐、腹瀉、脫水和酸堿平衡紊亂為特征。感染牛常發(fā)生死亡，病死率可達(dá)50%。

目前檢疫、診斷BRV常用的方法為中和試驗(yàn)、病毒分離、瓊擴(kuò)試驗(yàn)、RT-PCR等。但這些方法都存在著檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)或敏感性低等缺點(diǎn)，尤其對(duì)處于免疫耐受和持續(xù)性感染的牛容易出現(xiàn)漏檢。研究以實(shí)驗(yàn)室分離并保存的BRV-DQ株建立了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法，旨在為牛輪狀病毒的快速診斷和病原學(xué)調(diào)查提供一種更好的方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、毒株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

MA104細(xì)胞黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。牛輪狀病毒（BRV-DQ株），牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）、牛冠狀病毒（BCV）和牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）均由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室分離保存；待檢40份牛腹瀉樣品收集于大慶某牧場(chǎng)；2.0-2.5 kg的健康雄性家兔，購(gòu)買于當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶；體重18-22 g昆明小鼠，購(gòu)買于長(zhǎng)春生物制品研究所。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清、胰蛋白酶（1∶250）均購(gòu)自GIBCO公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體購(gòu)自 Sigma公司；Q sepharoseTMFast Flow購(gòu)自HiPrep公司。

TrizolReagent購(gòu)自Invitrogen公司；M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶（200U·μL-1）、HPR IRNA酶抑制劑（40U·μL-1）、dNTP（10mmoL·L-1）、LA Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）、dNTPs（2.5 mmoL·L-1）、DNA Marker DL2 000均購(gòu)自TaKaRa公司；DEPC水、瓊脂糖均購(gòu)自Sigma公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 病毒的培養(yǎng)及純化

將輪狀病毒與終濃度為20μg·mL-1的胰蛋白酶37℃作用1 h，接種于已長(zhǎng)成單層處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MA104細(xì)胞，0.5 mL·瓶-1，37 ℃吸附 1 h，間隔15min輕搖1次，使濾液與細(xì)胞充分接觸。吸附后倒凈殘液，加入4.5 mL含5μg·mL-1胰酶的維持液（不含血清），于37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)出現(xiàn)80%細(xì)胞病變（CPE）時(shí)收毒，-80℃反復(fù)凍融3次后，12 000 r·min-14℃離心1 h，40 000 rpm 4℃離心240min，棄上清，收集病毒，用PBS重新懸浮病毒，用基因定量?jī)x測(cè)定其濃度。然后將其分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 鼠、兔抗BRV IgG的制備與純化

1.4.1 鼠抗BRV超免疫血清的制備

以純化的BRV加弗氏完全佐劑背部皮下多點(diǎn)注射首免小鼠，100μg·只-1；間隔7 d用滅活的BRV加弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，100μg·只-1，連續(xù)2次，每次間隔7 d，最后1次免疫后7 d當(dāng)血清瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)1∶16以上時(shí)，即采血分離血清。

1.4.2 兔抗BRV超免疫血清的制備

以純化的BRV加弗氏完全佐劑兔兩側(cè)掌（拓）內(nèi)皮下注射首免家兔，200μg·只-1；第15 d用BRV加弗氏不完全佐劑皮下多點(diǎn)注射加強(qiáng)免疫，500μg·只-1；第30 d肌肉注射混有雙抗的牛IgG抗原200μg，三免1周后，當(dāng)血清瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)1∶16以上時(shí)，即采血分離血清。

1.4.3 兔、鼠抗BRV IgG的純化

用飽和硫酸銨沉淀法[3]粗提兔、鼠抗BRV IgG，再以陰離子交換層析（Q sepharoseTMFast Flow）純化[3，4]，用ELISA檢測(cè)活性蛋白，收集含量最多的活性蛋白峰。并用SDS-PAGE測(cè)定其純度，基因定量?jī)x測(cè)定其濃度。

1.5 間接夾心ELISA方法的建立

1.5.1 操作程序

按文獻(xiàn)[3]進(jìn)行操作。

1.5.2 最佳反應(yīng)條件的選擇

在不同的反應(yīng)條件下，對(duì)兔抗BRV IgG包被量（20、10、5、2.5μg·mL-1），鼠抗BRV IgG工作濃度（20、10、5、2.5、1.25μg·mL-1），HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG稀釋度（1∶2 500、1∶5 000、1∶10 000），封閉液的選擇（1%明膠、5%脫脂乳、1%BSA、10%胎牛血清），封閉時(shí)間（37℃反應(yīng)30、60、90、120 min）進(jìn)行ELISA方陣試驗(yàn)，檢測(cè)同一陽(yáng)性樣品和陰性樣品，測(cè)定OD450nm值，并計(jì)算P/N值，確定兔抗BRV IgG最佳包被濃度、鼠抗BRV IgG最佳濃度、最佳封閉液、封閉時(shí)間及酶標(biāo)抗體工作濃度。

1.5.3 ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)

用建立的ELISA方法測(cè)定30份BRV陰性樣品，計(jì)算OD450nm平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，陽(yáng)性臨界值=陰性O(shè)D450nm平均值+3×標(biāo)準(zhǔn)差，當(dāng)樣品OD450nm值大于陽(yáng)性臨界值時(shí)即判為陽(yáng)性，小于此值則判為陰性。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

1.6.1 板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

在同一塊酶標(biāo)板內(nèi)檢測(cè)5份不同抗原水平的樣品，每份樣品重復(fù)4孔，按最佳條件進(jìn)行ELISA。計(jì)算同一份樣品OD450nm值的變異系數(shù)（CV），以檢驗(yàn)板內(nèi)檢測(cè)樣品的重復(fù)性。

1.6.2 板間重復(fù)性試驗(yàn)

取4塊酶標(biāo)板，以同一批制備的抗體包被，在相同條件下5份不同抗原水平的樣品，按最佳條件進(jìn)行ELISA，計(jì)算同一份樣品在不同板間OD450nm值的變異系數(shù)（CV），以檢驗(yàn)板間檢測(cè)樣品的重復(fù)性。

1.7 特異性試驗(yàn)

將本實(shí)驗(yàn)室保存的牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）、牛冠狀病毒（BCV）和牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）進(jìn)行稀釋，同時(shí)設(shè)BRV標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性作為對(duì)照，每種樣品做2個(gè)重復(fù)，按照雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.8 靈敏性試驗(yàn)

將純化的BRV細(xì)胞毒測(cè)定含量后，按1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120倍比稀釋，各取100μL進(jìn)行ELISA檢測(cè)，計(jì)算最低病毒檢出量。

1.9 以RT-PCR試驗(yàn)為參照評(píng)估本ELISA檢測(cè)方法

40份牛糞便樣品采自大慶地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)，糞便用pH7.0的PBS稀釋成200mg·mL-1懸液，微型旋渦振蕩2 min，3 000 r·min-1冷凍離心10 min，取上清液，利用本試驗(yàn)建立的ELISA檢測(cè)方法與RT-PCR[5]同時(shí)檢測(cè)，并將這2種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，確定本方法的特異性、敏感性和符合率。RT-PCR檢測(cè)的陰性樣品用ELISA檢測(cè)為陰性的檢出率即為特異性；RT-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性樣品用ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的檢出率即為敏感性；兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致的血清樣本總數(shù)占總體樣本的比例即為兩者的符合率[6]。

2 結(jié)果

2.1 病毒的純化

牛輪狀病毒經(jīng)差速離心（12 000 r·min-14℃離心60 min，40 000 rpm 4℃離心240min）純化，測(cè)定的含量為3.60mg·mL-1。

2.2 鼠、兔抗BRV IgG的純化

鼠、抗BRV超免疫血清經(jīng)陰離子交換層析后，共收集到4個(gè)蛋白峰，經(jīng)檢測(cè)，第2～4峰為活性峰，收集產(chǎn)量最大的第3峰蛋白用于ELISA，測(cè)定其含量為2.44mg·mL-1。兔抗BRV超免疫血清經(jīng)陰離子交換層析后共收集到4個(gè)蛋白峰，經(jīng)檢測(cè)，第2～4峰為活性峰，收集產(chǎn)量最大的第2峰蛋白用于ELISA，測(cè)定其含量為2.56mg·mL-1。

2.3 雙抗體夾心ELISA方法的建立

2.3.1 最佳反應(yīng)條件的確定

通過(guò)ELISA方陣試驗(yàn)確定了主要的工作條件：兔抗BRV IgG最佳包被濃度為10μg·mL-1；鼠抗BRV IgG最佳濃度為5μg·mL-1；酶標(biāo)羊抗鼠IgG最佳工作濃度為1∶5 000；最佳封閉液為5%脫脂乳；最佳封閉時(shí)間為1 h。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兔抗BRV IgG和鼠抗BRV IgG最適工作濃度的確定Table 1 Determination of the optimal concentration of coating antibody and mouse-anti-BRV-IgG

2.3.2 ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)

用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)30份陰性樣品的OD450nm值，根據(jù)公式計(jì)算陽(yáng)性臨界值=陰性O(shè)D450nm平均值+3×標(biāo)準(zhǔn)差=0.225 5+0.068 8×3=0.432。因此，以O(shè)D450nm值=0.432作為ELISA結(jié)果判定的臨界值。在陰性和陽(yáng)性對(duì)照成立的情況下，確定OD450nm值≥0.432時(shí)，則判為 BRV抗體陽(yáng)性；OD450nm值＜0.432時(shí)，則判為BRV抗體陰性。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的ELISA檢測(cè)5份不同抗原水平的樣品，每份樣品重復(fù)4次，重復(fù)性分析結(jié)果可見(jiàn)其板內(nèi)變異系數(shù)在3.64%～5.87%之間，板間變異系數(shù)在4.60%～8.75%之間，板間、板內(nèi)變異系數(shù)勻小于10%，說(shuō)明此方法具有較好的重復(fù)性。

在新一代技術(shù)融合圖書(shū)館服務(wù)的實(shí)踐中，手機(jī)技術(shù)是應(yīng)用廣泛而投入較小的。我團(tuán)隊(duì)于2016年與本地一家公司合作，圍繞紙質(zhì)圖書(shū)服務(wù)設(shè)計(jì)了10多種功能，實(shí)施效果良好。基于此，該項(xiàng)目在2018年6月獲得了全國(guó)高校應(yīng)用案例二等獎(jiǎng)。

2.5 特異性試驗(yàn)

建立的雙抗體夾心ELISA只與BRV陽(yáng)性樣品反應(yīng)，與其他3種牛病的陽(yáng)性樣品的OD450nm值均小于0.432，無(wú)交叉反應(yīng)性，表明本試驗(yàn)所建立的雙抗體夾心ELISA方法有較好的特異性。

2.6 靈敏性試驗(yàn)

隨著病毒含量的降低，其OD450nm值呈線性下降，當(dāng)純化病毒1∶2 560稀釋（病毒含量為1.41μg·mL-1）時(shí)，結(jié)果為陽(yáng)性（OD450nm值為0.491），而稀釋度為1∶5 120時(shí)，結(jié)果為陰性（OD450nm值為0.403），則該方法可檢測(cè)的最低病毒濃度為1.41μg·mL-1，具有較高的敏感性。

2.7 以RT-PCR試驗(yàn)為參照評(píng)估本ELISA檢測(cè)方法

利用本試驗(yàn)建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法與RT-PCR試驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)40份牛糞便樣品，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表 2，利用制備的兔抗 BRV IgG和鼠抗BRV IgG蛋白建立的雙抗體夾心ELISA與RT-PCR試驗(yàn)的符合率達(dá)95%。

表2 雙抗體夾心ELISA方法與RT-PCR試驗(yàn)的比較結(jié)果Table 2 Comparison between Sandwich ELISA and RT-PCR test for detecting field samples

3 討論

建立雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)牛輪狀病毒，其中使用的兔、鼠抗BRV IgG純度是試驗(yàn)成功的關(guān)鍵，其純度越高（非特異性抗體和雜蛋白越低），非特異性反應(yīng)越低。本試驗(yàn)通過(guò)硫酸銨沉淀后用陰離子交換層析的方法，對(duì)自制的兔、鼠抗BRV IgG進(jìn)行純化，以達(dá)到降低非特異性反應(yīng)的目的。

離子交換層析與硫酸銨沉淀法聯(lián)合使用可以有效地純化抗體。初步分離純化時(shí)，采用飽和硫酸銨（SAS），依次以50%、40%、33%飽和度的硫酸銨溶液純化一次，即可得到較純的抗體粗制品[7]。本試驗(yàn)根據(jù)lgG的特性，和其等電點(diǎn)為5.5～8.3的性質(zhì)，選用Q sepharoseTMFast Flow陰離子交換柱對(duì)其進(jìn)行純化。Q sepharoseTMFast Flow陰離子交換柱是目前國(guó)際上趨向于使用的一種強(qiáng)離子交換劑，其具有流速高，交換容量大等特點(diǎn)，適用于IgG的純化。使用Q sepharoseTMFast Flow陰離子交換柱在pH8.5條件下對(duì)鼠、兔抗BRV IgG粗提產(chǎn)物進(jìn)行純化，能夠?qū)⒛康牡鞍追蛛x出來(lái)。較高pH值的Buffer A對(duì)免疫球蛋白的活性并沒(méi)有產(chǎn)生影響。并以牛輪狀病毒為包被抗原建立間接ELISA方法，測(cè)定不同蛋白峰活性，結(jié)果表明同時(shí)有多個(gè)蛋白峰都具有免疫活性，取不同活性峰蛋白以SDS-PAGE來(lái)鑒定其純度，并篩選試驗(yàn)使用所需的蛋白峰。該方法可獲得濃度大、純度高的目的蛋白。

試驗(yàn)通過(guò)方陣滴定試驗(yàn)對(duì)雙抗體濃度和酶標(biāo)羊抗鼠IgG濃度條件進(jìn)行篩選，確定鼠抗BRV IgG、兔抗BRV IgG和酶標(biāo)羊抗鼠IgG稀釋度為5μg·mL-1、10μg·mL-1、1∶5 000時(shí)，效果最好。并對(duì)最佳封閉液，最佳封閉時(shí)間，最佳二抗工作濃度進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，盡最大可能低了非特異性反應(yīng)的發(fā)生，從而提高了其敏感性。試驗(yàn)證明只在檢測(cè)牛輪狀病毒陽(yáng)性抗原時(shí)，ELISA反應(yīng)呈陽(yáng)性，而與牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）、牛冠狀病毒（BCV）和牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）抗原呈陰性反應(yīng)，說(shuō)明所建立的雙抗體夾心ELISA方法具有特異性。

本試驗(yàn)建立的雙抗體夾心ELISA，可應(yīng)用于快速檢測(cè)牛輪狀病毒抗原，其敏感性較高，最低能檢測(cè)到含量為1.41μg·mL-1的輪狀病毒抗原。并與其中檢測(cè)抗原的RT-PCR方法進(jìn)行比較，符合率為95%。由此可見(jiàn)，雙抗體夾心ELISA方法與RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果具有較高的符合率。

在細(xì)胞培養(yǎng)物和糞便樣品標(biāo)本中均存在三種形式的病毒粒子，即具有雙層衣殼的完整病毒粒子（由VP1，2，3，4，6，7組成），具有單層衣殼的病毒粒子（由VP1，2，3，6組成），不成熟的只有空衣殼的病毒顆粒（由VP1，2，3組成）[8]，其中單層衣殼的病毒粒子以VP6蛋白為外衣殼，并且在A群輪狀病毒中，VP6蛋白的基因在序列上具有高度的保守性，且蛋白具有良好的抗原性和免疫原性[9]，從理論上使本試驗(yàn)建立的雙抗體ELISA可檢測(cè)不同血清型的A群輪狀病毒成為可能。

目前，牛輪狀病毒在世界范圍內(nèi)分布較廣，感染率也較高，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)危害極大[10]。本研究以純化的兔、鼠抗BRV IgG為原料建立雙抗體夾心ELISA方法，其特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、省時(shí)省力、操作簡(jiǎn)便，易于推廣應(yīng)用，適合大批量地檢測(cè)，為BRV檢測(cè)試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。

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