陳莉華，張俊生，張 麗，王迎春 ，王 嬌

（1.吉首大學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000；

2.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000）

節(jié)節(jié)草（Equisetum ramosissimumDesf）又稱銼草、筆筒草、節(jié)骨草，是木賊科木賊屬植物，生于山坡林下蔭濕處、河岸濕地、甚至雜草地，在湘西各地隨處可見。節(jié)節(jié)草地上部分干燥后可入藥，在《中華人民共和國藥典（一部）》[1]中學(xué)名為木賊（Equisetum hiemaleL.），具有疏風(fēng)、明目、活血、舒筋之功效，民間常用于治療迎風(fēng)流淚、翳膜遮睛、跌打損傷、腸風(fēng)、血痔等疾病[2]。研究表明，節(jié)節(jié)草中除含有犬問荊堿、犬問荊定堿、小量的菸堿等生物堿外，還含有芹菜素、槲皮素、山奈酚、木栓醇等化合物[3]。

生物堿具有抗菌消炎的作用。如，白屈菜紅堿對植物病原真菌具有抗菌作用[4]；博落回生物堿對多種真菌有抗菌作用[5]；砂生槐子生物堿具有抑制G+金黃色葡萄球菌、G-大腸埃希菌生長繁殖的藥效，以對金黃色葡萄球菌的抑制作用更為顯著[6]；黃連中的小檗堿，可以廣譜抑制病原微生物，如細(xì)菌、真菌和原蟲，用于很多疾病的治療[7]。但迄今為止，關(guān)于節(jié)節(jié)草中生物堿提取及抑菌活性的研究，鮮有報(bào)道。

考慮到可操作性和可推廣性，本試驗(yàn)以采集自湘西地區(qū)的野生節(jié)節(jié)草為試驗(yàn)材料，采用以鹽酸為提取液、以濃氨水沉降、濾集沉淀的方法提取總生物堿，并測定提取物對多種細(xì)菌與真菌的抑菌活性，以期為湘西野生藥物資源深加工提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

儀器：HH-S型水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SHB-Ⅲ循環(huán)式真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），ZDP-2120型電熱培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品）。

材料：野生節(jié)節(jié)草，采于湘西吉首健身坡，經(jīng)吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境學(xué)院植物教研室鑒定。

試劑：鹽酸、濃氨水、碘化鉍鉀試劑、碘-碘化鉀、硅鎢酸均為分析純。

試驗(yàn)菌種：藤黃微球菌、黑曲霉菌、青霉菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、產(chǎn)氣桿菌（以上菌種均由吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院微生物教研室提供）。

細(xì)菌培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基、霉菌培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 節(jié)節(jié)草總生物堿的提取 新鮮節(jié)節(jié)草于80℃下鼓風(fēng)干燥3 h，取出，剪成長2 cm的段狀。準(zhǔn)確稱取5 g，用一定量的鹽酸，在一定溫度下的水浴中攪拌提取若干次，每次約1 h。合并多次鹽酸提取液，加濃氨水至pH值9～10，靜置24 h充分沉降，濾集沉淀，在50℃下鼓風(fēng)干燥，即得節(jié)節(jié)草總生物堿。

1.2.2 提取條件的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)通過單因素試驗(yàn)確定最佳試驗(yàn)值。選取鹽酸濃度、固液比、提取溫度、提取次數(shù)等4個(gè)因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平,按L9（34）正交表對提取工藝進(jìn)行研究，確定節(jié)節(jié)草生物堿鹽酸提取法的最佳工藝參數(shù)。

1.2.3 節(jié)節(jié)草總生物堿的定性檢測 用碘化鉍鉀、碘-碘化鉀、硅鎢酸等3種試劑進(jìn)行總生物堿的定性鑒定。將制得的節(jié)節(jié)草粗堿稱取100 g，配制成25mg/mL的溶液。取樣品液各10mL，分置于3個(gè)試管，分別加入上述3種試劑，觀察現(xiàn)象。

1.2.4 總生物堿的精制 依武蕓等的方法[8]，將生物堿粗品溶于 200 mL蒸餾水中,用6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)其pH值為3～3.5，用乙醚洗滌兩次，10 mL/次，棄去乙醚層，在水層中用體積分?jǐn)?shù)10%的氨水調(diào)節(jié)pH值為10，再用氯仿萃取2次，方法同上。將所得氯仿液進(jìn)行蒸餾，即可得總生物堿精制品。

1.2.5 菌懸液的制備 先將試驗(yàn)所用菌株接種于平板上，37℃培養(yǎng)24 h。然后挑選典型菌落接種于液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水將其制成含菌 1×106～1×107cfu/mL 的菌懸液，備用。

1.2.6 抑菌效果測定 （1）紙片擴(kuò)散法測定抑菌圈。用紙片法進(jìn)行抑菌效果測定。在無菌操作臺上將滅菌后的固體培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿15～20 mL，待冷卻凝固后，用微量移液器移取200 μL菌液加到平皿上，用涂布棒將菌液涂布均勻，將制得的生物堿配成一定濃度的溶液，將浸透生物堿樣品液的濾紙片揮干，用無菌鑷子夾取，將其貼在含菌平板上，然后用無菌生理鹽水將其濡濕，每皿貼四片。細(xì)菌于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，霉菌于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，重復(fù)3次，測定濾紙片的抑菌圈直徑大小。（2）最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定。采用平板稀釋法，將最優(yōu)條件下制備的節(jié)節(jié)草生物堿用無菌蒸餾水進(jìn)行倍比稀釋，制備 0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36mg/mL 系列濃度稀釋液。然后用無菌吸管將稀釋液分別定量加入到無菌培養(yǎng)皿中,與定量倒入的培養(yǎng)基充分混勻，靜置凝固后,制成含藥液平板。再按培養(yǎng)皿上標(biāo)的計(jì)量，用移液管分別吸取定量被試菌液,涂于平板上，置于適宜溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察菌落生長情況，以平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落數(shù)，另取一系列不加任何藥液的平板作為空白對照。肉眼觀測，以完全沒有菌落生長的最低生物堿濃度作為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。將培養(yǎng)皿置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 節(jié)節(jié)草總生物堿提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 鹽酸濃度對總堿提取量的影響 稱取節(jié)節(jié)草5 g，在85℃水浴溫度下，用不同濃度HCl 50mL提取2次，每次提取時(shí)間約1 h。

隨著HCl濃度的增大，總生物堿提取量也逐步增大。當(dāng) HCl濃度為0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%時(shí)，總生物堿提取量分別為0.305 6 g、0.330 7 g、0.331 8 g、0.384 9 g、0.431 2 g。其中，以鹽酸濃度為1.5%時(shí)的總生物堿提取量最大。因此，選用此鹽酸濃度進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

2.1.2 固液比對總堿提取量的影響 在其他條件相同的情況下，改變固液比進(jìn)行提取，結(jié)果如下：當(dāng)固液比為 1∶10、1∶14、1∶18、1∶22、1∶26 時(shí)，總生物堿提取量分別為 0.340 1 g、0.398 8 g、0.422 7 g、0.406 5 g、0.308 0 g。

由以上結(jié)果可知，隨著固液比的增加，總生物堿提取量也逐步增大，到1∶18時(shí)達(dá)到極值。此后，總生物堿提取量隨著固液比的上升而下降，當(dāng)固液比為1∶26時(shí)，總生物堿提取量劇烈下降。因此，選定固液比為1∶18進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 提取溫度對總堿提取量的影響 當(dāng)提取溫度為70℃、75℃、80℃、85℃、90℃時(shí)，總生物堿提取量分別為 0.231 0 g、0.282 3 g、0.252 4 g、0.312 8 g、0.286 7 g。其中，當(dāng)提取溫度為85℃時(shí)，得到的總堿量最大，故后續(xù)試驗(yàn)中選取溫度為85℃。

2.1.4 提取次數(shù)對總堿提取量的影響 稱取一定量的節(jié)節(jié)草樣品，在85℃水浴溫度下，按照上述條件提取若干次，每次提取時(shí)間約1 h。當(dāng)提取1次、2次、3次、4次、5次時(shí)，總生物堿提取量分別為0.135 2 g、0.324 5 g、0.416 5 g、0.518 2 g、0.519 4 g。

由以上結(jié)果可知，隨著提取次數(shù)的增多，提取物中總堿含量增大，但提取次數(shù)過多，會(huì)使得生產(chǎn)周期過長，綜合考慮后，選用提取次數(shù)為2次。

2.2 節(jié)節(jié)草總生物堿提取工藝的正交試驗(yàn)

以總堿量為指標(biāo),考察提取工藝中鹽酸濃度、固液比、提取溫度、提取次數(shù)等4個(gè)因素對提取量的影響，設(shè)計(jì)了如下的因素水平表并進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見見表1及表2。

表1 正交試驗(yàn)因素表

試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對提取效果的影響程度依次為：提取次數(shù)>固液比>提取溫度>鹽酸濃度。這表明，在以鹽酸為提取液的節(jié)節(jié)草生物堿提取方法中，提取次數(shù)對節(jié)節(jié)草生物堿有顯著影響，固液比次之，而鹽酸濃度的影響不大，優(yōu)選工藝為A3B3C2D3，即 1.25%的鹽酸，固液比 1∶18，在 90℃水浴提取3次，每次提取1 h。

2.3 節(jié)節(jié)草總生物堿的定性鑒定

用碘化鉍鉀、碘-碘化鉀、硅鎢酸等3種試劑聯(lián)合進(jìn)行總生物堿的定性鑒定，3種試劑均須有明顯反應(yīng)才能證明有生物堿存在。參照1.2.3的方法，各試劑表現(xiàn)的現(xiàn)象分別為有棕紅色沉淀、無定形沉淀、有結(jié)晶形沉淀。監(jiān)定結(jié)果證實(shí)，有生物堿成分存在。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.4 節(jié)節(jié)草總生物堿抑菌試驗(yàn)

2.4.1 節(jié)節(jié)草總生物堿抑菌圈直徑的測定 按1.2.6的試驗(yàn)方法，用節(jié)節(jié)草總生物堿樣品液進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌圈直徑越大表明抑菌效果越好，結(jié)果見表3。

表3 節(jié)節(jié)草生物堿的抑菌活性

試驗(yàn)結(jié)果表明，節(jié)節(jié)草總生物堿對奇異變形桿菌、大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）、藤黃微球菌有強(qiáng)的抑菌活性；對黑曲霉菌、枯草桿菌、產(chǎn)氣桿菌都有較強(qiáng)的抑菌活性；但對青霉菌、金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌）沒有表現(xiàn)出抑菌活性。

2.4.2 節(jié)節(jié)草總生物堿最小抑菌濃度的測定 按1.2.6的試驗(yàn)方法，用節(jié)節(jié)草總生物堿樣品液進(jìn)行體外最小抑菌濃度試驗(yàn)，抑菌圈直徑越大表明抑菌效果越好，結(jié)果見表4。

表4 節(jié)節(jié)草總生物堿MIC的測定結(jié)果 （cfu/mL）

由表4可知，節(jié)節(jié)草總生物堿對大腸桿菌、藤黃微球菌的最小抑菌濃度為0.16mg/mL，對奇異變形桿菌、枯草桿菌、黑曲霉菌的最小抑菌濃度為0.20 mg/mL，對產(chǎn)氣桿菌的最小抑菌濃度為0.24 mg/mL。這表明，節(jié)節(jié)草總生物堿對這6個(gè)菌種均具有較好的抑菌效果。由此看出，節(jié)節(jié)草總生物堿對致病菌有強(qiáng)的抑菌效果，與民間用于治病的習(xí)俗互為佐證。

3 結(jié) 論

通過對節(jié)節(jié)草中總生物堿提取方法的單因素試驗(yàn)，確定了鹽酸濃度、提取次數(shù)、提取溫度、固液比等4個(gè)因素在正交試驗(yàn)中的水平。由L9（34）正交試驗(yàn)得出最佳提取工藝條件為：1.25%的鹽酸，固液比為1∶10，90℃水浴提取3次，每次提取1 h。通過對節(jié)節(jié)草總生物堿抑菌性的研究，可知節(jié)節(jié)草總生物堿對大部分菌種具有較強(qiáng)的抑菌活性，而對青霉菌、金黃葡萄球菌沒有表現(xiàn)出抑菌活性。

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