赫麗娟 王 鶴 任同軍 姜志強 韓雨哲

維生素C又名抗壞血酸，是魚類和哺乳動物組織膠原蛋白合成過程中脯氨酸羥基化必需的物質(zhì)，具有廣泛的生理和免疫作用，能夠促進養(yǎng)殖動物快速生長，緩解養(yǎng)殖魚類的應(yīng)激狀態(tài)，增強機體抵抗病原微生物感染能力及免疫功能[1]。維生素C對魚類的生長發(fā)育、繁殖、抗病、抗應(yīng)激和提高存活率等方面有重要的作用[2]。魚類缺乏維生素C經(jīng)常出現(xiàn)脊椎彎曲、軟骨變形、膠原形成損傷、皮膚出血和內(nèi)臟出血等癥狀。由于大多數(shù)魚類缺少合成維生素C所必需的L－古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶，因此，在體內(nèi)不能合成維生素C，只能通過食物獲取外源維生素C[3]。餌料中缺乏維生素C容易使魚類的生長放慢，免疫功能減弱，病害增多，死亡率提高。由于仔魚階段魚苗的體質(zhì)較弱，因此需要在飼料中添加適量維生素C。維生素C對水產(chǎn)動物生長的影響一直是魚類營養(yǎng)與飼料研究的重點。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）原產(chǎn)地分布于北太平洋西部，我國黃海和渤海產(chǎn)量較大。牙鲆以其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富而深受人們的喜愛，市場需求旺盛，經(jīng)濟價值較高[4]。目前，牙鲆的營養(yǎng)，特別是仔、稚魚的營養(yǎng)與飼料問題較突出，雖然已有部分國產(chǎn)飼料應(yīng)用于生產(chǎn),但是仍有許多生產(chǎn)單位育苗飼料需要依靠進口[5]。有關(guān)牙鲆對維生素C的需要報道較多，但基本上都集中在牙鲆幼魚和成魚階段的研究，而對牙鲆仔魚階段的研究較少。文中主要研究不同劑量的維生素C對褐牙鲆仔魚階段存活率以及抗應(yīng)激能力的影響，為配制牙鲆仔魚的配合飼料提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗飼料

1.1.1 飼料的配制

飼料主要的蛋白源為魚粉、磷蝦粉和魷魚粉；基礎(chǔ)飼料主要原料為混合維生素（不含有維生素C）、混合礦物質(zhì)、n-3系列不飽和脂肪酸、魚肝油、α-糊精等。VC的添加使用的是VC磷酸酯，VC磷酸酯的有效抗壞血酸含量為35%，并將不同量的維生素C添加到配合飼料中，使其達到試驗所要求的含量標(biāo)準(zhǔn)。將這些成分加入粘合劑使之充分混合，處理成片狀后烘干，24 h后取出放入研缽中研碎，過100目篩，篩下物即可作為試驗飼料使用。飼料配方及飼料編號見表1。

表1 飼料配方（g/kg干物質(zhì)）

1.1.2 飼料成分的測定

水分測定采用恒溫干燥法(105℃)；粗蛋白測定采用半微量凱氏定氮法；粗脂肪測定采用索氏抽提法；粗灰分測定采用馬福爐灼燒法(550℃)[6]。飼料的營養(yǎng)成分見表2。

表2 飼料的營養(yǎng)成分（%）

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗仔魚是由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實驗站提供的全雌牙鲆卵，在大連水產(chǎn)學(xué)院農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖重點實驗室孵化。前期飼養(yǎng)階段，將初孵仔魚放入170 cm×90 cm×56 cm，容積0.86 m3的暫養(yǎng)池中，仔魚開口后投喂輪蟲，輪蟲的投喂密度為2～3個/ml水體。投喂的褶皺臂尾輪蟲，是在本實驗室由土池培養(yǎng)的輪蟲休眠卵孵化而來，輪蟲培養(yǎng)密度保持在160個/ml以上，輪蟲培養(yǎng)前期投喂本實驗室三級培養(yǎng)的小球藻液以及酵母，由于小球藻液數(shù)量有限，培養(yǎng)后期改為小球藻濃縮液。投喂前，將輪蟲用稀釋100倍的輪蟲強化劑（0.8～0.9 g/百萬個）強化12 h后投喂。經(jīng)過三周的前期飼養(yǎng)，挑選規(guī)格整齊的仔魚平均放入15個160 L的塑料圓桶中進行流水式養(yǎng)殖，每桶放牙鲆仔魚350尾左右。仔魚的初始規(guī)格：平均體長為（8.2±0.6）mm，平均體重為（3.8±0.5）mg。

試驗由2009年3月31日至2009年4月20日，共21 d。飼養(yǎng)階段7:30～17:30，每小時投飼一次。每日上午9:00虹吸法吸底，同時清除殘餌及糞便，整個飼養(yǎng)階段采用微流水養(yǎng)殖，水流速度約為0.1 l/min，24 h充氣。室溫使用空調(diào)控制，控制室溫在整個試驗過程中穩(wěn)定在25℃。每天記錄飼養(yǎng)仔魚死亡尾數(shù)。同時測定鹽度、水溫以及溶氧等水質(zhì)指標(biāo)，試驗期間，鹽度為33±1，水溫 15～17 ℃，溶氧 6.63～7.78 mg/l(YSI,550I,USA)。

1.3 高溫應(yīng)激試驗和露空試驗

將15桶試驗仔魚分別隨機取出10尾，將仔魚分別放入200 ml的燒杯中，將燒杯置于25℃的恒溫水浴中2 h，每5 min檢查其存活情況，記錄死亡量。

將15桶試驗仔魚分別隨機取出10尾，離水，放于干燥的篩絹網(wǎng) (100目)上，5 min后，將試驗仔魚無傷的放回裝有原槽水的新水槽中，3 h后觀察試驗仔魚的存活情況，并記錄死亡量。

1.4 計算方法

存活率(%)=[（初始尾數(shù)－死亡尾數(shù)）/初始尾數(shù)]×100。

1.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±S.D.）表示，對試驗數(shù)據(jù)進行了單因素方差分析（One－way ANOVA），并對不同處理間的數(shù)據(jù)進行Duncan's法多重比較，以P＜0.05作為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用SPSS13.0軟件包進行處理，并用Excel 2003制表、制圖。

2 結(jié)果（見圖 1、2、3）

圖1 不同維生素C含量飼料對牙鲆仔魚存活率的影響

不同維生素C含量的飼料對牙鲆仔魚存活率的影響如圖1所示。從結(jié)果可以看出，牙鲆仔魚的存活率受飼料中維生素C含量的影響。在飼料中添加1.43 g/kg維生素C磷酸酯(L－AMP)能顯著提高牙鲆仔魚的存活率(P＜0.05)，繼續(xù)升高飼料中L－AMP含量則不會繼續(xù)顯著提高牙鲆仔魚的存活率。

圖2 不同維生素C含量飼料對牙鲆仔魚高溫應(yīng)激后存活率的影響

不同維生素C含量的飼料對牙鲆仔魚的高溫應(yīng)激能力產(chǎn)生了影響，結(jié)果如圖2所示。用不添加維生素C的飼料飼喂的牙鲆仔魚高溫應(yīng)激后的存活率顯著低于飼喂添加2.86 g/kg和5.72 g/kg L－AMP的飼料組(P＜0.05)，即飼料4和飼料5。飼料中添加1.43 g/kg以上維生素C磷酸酯(L－AMP)的各組間高溫應(yīng)激后，牙鲆仔魚的存活率沒有顯著差異。

圖3 不同維生素C含量飼料對牙鲆仔魚露空應(yīng)激后存活率的影響

飼料中維生素C含量的不同并未對牙鲆仔魚抗露空應(yīng)激的能力產(chǎn)生顯著影響（見圖3）。但是未添加維生素C的飼料組飼喂的牙鲆仔魚，在露空應(yīng)激后存活率最低（P＞0.05）。

3 討論

維生素C是水產(chǎn)動物所必需的重要維生素。對于水產(chǎn)動物其主要的生理功能：首先，維生素C作為水產(chǎn)動物重要的免疫增強劑而發(fā)揮作用[3]。其次，維生素C能提高水產(chǎn)動物的抗逆性[7]。第三，維生素C對飼料中某些微量添加劑有正協(xié)同效應(yīng)，起到節(jié)約飼料中的微量添加劑的作用，維生素C能促使葉酸轉(zhuǎn)變成四氫葉酸，協(xié)助酪氨酸的代謝，減輕維生素A、維生素B1等的缺乏癥[8]。第四，維生素C對水產(chǎn)動物骨骼的發(fā)育有重要的影響[7]。第五，維生素C對水產(chǎn)動物的行為有所影響[9]。

本研究中，飼料中添加1.43 g/kg的VC磷酸酯能顯著提高牙鲆仔魚的存活率(P＜0.05)，但是繼續(xù)升高飼料中的VC含量，并不會顯著提高牙鲆仔魚的存活率(P＞0.05)。添加0.29 g/kg VC磷酸酯的飼料飼喂的牙鲆仔魚，其存活率并未顯著高于未添加VC的飼料。結(jié)果表明，飼料中添加一定量的維生素C能提高牙鲆仔魚的存活率。這也與之前的許多試驗結(jié)果類似，Ai等[7]在以L－APP為維生素C源對花鱸（Lateolabrax japonicus）維生素C需求量的試驗中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加489 mg/kg飼料或高于這個劑量會顯著地提高血清溶菌酶活力和血清替代補體活力。Lin等[10]在石斑魚（Epinephelus malabaricus）飼料中添加100%抗壞血酸，當(dāng)添加量達到生長最適添加量（45.3 mg/kg飼料）的6倍時，能顯著增強石斑魚的非特異性免疫反應(yīng)并能在攻毒試驗中顯著提高石斑魚的存活率。在本試驗中，當(dāng)繼續(xù)升高維生素C的含量時，牙鲆仔魚存活率出現(xiàn)了平臺期，這種現(xiàn)象的原因可能是由于添加維生素C產(chǎn)生的短暫免疫增強后，試驗動物對飼料中含有高劑量的維生素C環(huán)境出現(xiàn)了一定的適應(yīng)，并且在長期試驗的后期免疫功能無法體現(xiàn)[11]。張道波等[12]在以牙鲆幼魚為研究對象的試驗中發(fā)現(xiàn)，牙鲆幼魚飼料適宜的維生素C添加量為400～600 mg/kg。但是在本試驗中，牙鲆仔魚的適宜維生素C添加量應(yīng)高于1.43 g/kg，這個結(jié)論也證明了仔魚對維生素C的需求量高于幼魚。

本研究的結(jié)果表明，飼料中添加維生素C能顯著提高牙鲆仔魚的抗高溫應(yīng)激能力(P＜0.05)。高溫應(yīng)激存活率最高值出現(xiàn)在飼料中添加維生素C 2.86 g/kg的飼料組。高于保證飼養(yǎng)階段存活率最高值所需要的維生素 C 含量(P＞0.05)。Wahli等[13]在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的創(chuàng)傷恢復(fù)試驗中發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加維生素C能顯著提高虹鱒魚的創(chuàng)傷恢復(fù)能力，并且高劑量的維生素C添加量不但不會引起恢復(fù)速度的減緩反而會引起其加快恢復(fù)。Alexis等[14]在對金頭鯛（Sparus aurata L.）的試驗中得到了相似的結(jié)果。飼料中維生素C的含量從0 mg/kg飼料增加到3.2 g/kg飼料，同時金頭鯛的創(chuàng)傷恢復(fù)速度與維生素C的添加量呈線性正相關(guān)。這個結(jié)果說明在應(yīng)激刺激條件下，魚類為了保證正常生理狀態(tài)所必需的維生素C的量有所增加。從另一個角度反映了維生素C作為水產(chǎn)動物所必需的微量添加劑的生理功能。但是在露空應(yīng)激試驗中，這個結(jié)果卻并不顯著。不添加維生素C組的飼料飼喂的牙鲆仔魚，其露空存活率僅略低于添加維生素C的各組飼料 (P＞0.05)。造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于牙鲆仔魚對高溫應(yīng)激的抗逆性生理反應(yīng)機制與露空應(yīng)激不同，從而對維生素C的利用途徑不同所造成的[15]。具體的生理反應(yīng)需做進一步試驗證明。

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