馮定遠(yuǎn)

酶制劑作為一種具有生物活性的天然催化劑，通過與底物的結(jié)合，降低反應(yīng)所需要的活化能，可以極大地提高化學(xué)反應(yīng)速度。飼用酶制劑的研究開發(fā)和推廣應(yīng)用，已成為生物技術(shù)在飼料工業(yè)和養(yǎng)殖中應(yīng)用的重要領(lǐng)域，酶制劑作為一種新型高效飼料添加劑，為開辟新的飼料資源、降低飼料生產(chǎn)成本提供了行之有效的途徑，同時可以提高動物生產(chǎn)性能和減少養(yǎng)殖排泄物的污染，為飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)高效、節(jié)糧、環(huán)保等可持續(xù)發(fā)展提供了保障和可能性，而新型的飼料酶制劑不斷被研究和開發(fā)是重要前提。組合酶作為酶制劑產(chǎn)品設(shè)計(jì)的創(chuàng)新理念，有別于傳統(tǒng)的單酶和復(fù)合酶，能充分體現(xiàn)酶制劑的高效性、針對性，以“差異互補(bǔ)、協(xié)同增效”為核心理念。

1 飼料酶制劑的種類

至今為止，已發(fā)現(xiàn)有3000多種酶，用于飼料中只是其中很小的一部分。生物體內(nèi)生化代謝途徑中的酶可分為氧化還原酶類、水解酶類、轉(zhuǎn)移酶類、裂合酶類、異構(gòu)酶類和合成酶類等幾類。工業(yè)上應(yīng)用的酶制劑大多數(shù)為水解酶。酶制劑的分類按作用底物的不同，可分為淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果膠酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶、植酸酶、核糖核酸酶等。單胃動物能分泌到消化道內(nèi)的酶主要屬于蛋白酶、脂肪酶類和碳水化合物酶類。底物大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、脂肪、多糖等）在酶的催化下被降解為易被吸收的小分子物質(zhì)，如氨基酸、寡肽、脂肪酸、葡萄糖、寡糖等。飼料酶制劑的分類方法仍沒有統(tǒng)一，飼料酶制劑大致可分為外源消化酶和非消化酶兩大類。非消化酶是指動物自身不能分泌到消化道內(nèi)的酶，這類酶能消化動物自身不能消化的物質(zhì)或降解一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，主要有纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶等。外源消化酶是指動物自身能夠分泌，但大部分來源于微生物和植物的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶類等。催化水解同一種底物的酶可以有不同來源，例如，催化水解纖維素的酶有綠色木霉（Trichoderma viride）纖維素酶、嗜松青霉（Penicillium pinophilum）纖維素酶、生黃瘤胃球菌（R.flavefaciens）纖維素酶，等等。針對這一特點(diǎn)，我們先后系統(tǒng)地比較研究了不同來源的纖維素酶（黃燕華，2004）、不同來源的木聚糖酶（于旭華，2004）和不同來源的蛋白酶（未公開資料）。同樣，同一來源的生物，特別是微生物（包括真菌、細(xì)菌、放線菌等）可以產(chǎn)生不同的酶，例如，厭氧微生物能產(chǎn)生降解木聚糖、甘露聚糖的復(fù)合多酶系統(tǒng)。另外，所謂木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶等是一個籠統(tǒng)的概念，它們是一類作用相近的酶的統(tǒng)稱，例如，纖維素酶主要有三種，即內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。

所謂單酶或單一酶（Single Enzyme）是指特定來源而催化水解一種底物的酶制劑，如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、里氏木霉（T.reesei）纖維素酶、康寧木霉（Trichoderma koningii）纖維素酶、曲霉菌（Aspergillus）木聚糖酶、隱酵母（Cryptococcus）木聚糖酶等等，它們都是單酶。

與單酶相對應(yīng)的是復(fù)合酶。所謂復(fù)合酶（Complex Enzymes）是指由催化水解不同底物的多種酶混合（mix）而成的酶制劑。多種酶的來源可以不同，也可以相同，特別是有些商業(yè)系統(tǒng)微生物的固體發(fā)酵，單一菌株都可以產(chǎn)生多種酶。復(fù)合酶可以以動物種類及階段為目標(biāo)設(shè)計(jì)酶譜和活性，如蛋雞日糧專用酶；也可以以日糧特性為目標(biāo)配制酶的種類和有效成分，如小麥型日糧專用酶。目前飼料和養(yǎng)殖業(yè)使用的除少量是單酶添加劑外，大多數(shù)為復(fù)合酶添加劑。

2 組合酶和組合型復(fù)合酶的概念和特性

飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)面臨影響可持續(xù)發(fā)展三大問題：違禁藥物和促生長劑大量使用導(dǎo)致的飼料安全問題、未被充分吸收利用養(yǎng)分的大量排放造成的環(huán)境污染問題和常規(guī)飼料原料缺乏及價(jià)格上漲問題。飼料酶制劑由于其獨(dú)特的作用，被廣泛認(rèn)為是目前唯一能夠在不同程度同時解決這影響可持續(xù)發(fā)展三大問題的飼料添加劑。盡管這項(xiàng)技術(shù)已有了長足發(fā)展，但是迄今為止，全球單胃動物飼料僅有20%左右使用了酶，總價(jià)值約3億美元。于是飼料酶產(chǎn)業(yè)界質(zhì)疑：飼料酶的發(fā)展為什么不能更快些？尤其那些已經(jīng)顯示出良好商業(yè)前景的飼料酶。

當(dāng)然，酶制劑不能簡單等同于促生長劑，而且酶的影響因素很多，其發(fā)揮作用既有動物的因素，又有日糧的因素，還有酶本身的因素（Marquardt和Bedford，2001）。過去我們廣泛使用的是單一酶（如小麥型日糧添加一種單一的木聚糖酶），或者復(fù)合酶（如仔豬日糧使用蛋白酶和淀粉酶等組成的復(fù)合酶）。如何解決酶制劑使用的針對性和高效性是酶制劑發(fā)揮其效果的關(guān)鍵。目前在酶制劑理論研究和產(chǎn)品開發(fā)，恰恰在針對性和高效性存在很大的問題。應(yīng)該承認(rèn)，我們對酶在飼料中的應(yīng)用了解還很有限，有很大的盲目性。如何高效地發(fā)揮酶的催化功能，必須在酶制劑的應(yīng)用上，創(chuàng)新思維，構(gòu)建新的應(yīng)用體系。馮定遠(yuǎn)(2004)在討論飼料工業(yè)的技術(shù)創(chuàng)新時就提出了飼料酶制劑應(yīng)用的組合酶概念，它有別于傳統(tǒng)上的復(fù)合酶。此后，飼料酶行業(yè)已經(jīng)開始關(guān)注并實(shí)踐。

所謂組合酶（Combinative Enzymes）是指由催化水解同一底物的來源和特性不同，利用酶催化的協(xié)同作用，選擇具有互補(bǔ)性的兩種或兩種以上酶的配合 (formulate)而成的酶制劑。例如，蛋白酶組合酶制劑由多種來源不同的蛋白酶組成，可以有木瓜蛋白酶和黑曲霉蛋白酶，甚至其他來源的蛋白酶；木聚糖酶組合酶制劑由多種來源不同的木聚糖酶組成，真菌木聚糖酶和細(xì)菌木聚糖酶的組合；纖維素酶組合酶制劑由木霉纖維素酶和青霉纖維素酶組成等等。組合酶不是簡單的復(fù)合，而應(yīng)該是根據(jù)不同酶的最適特性、作用特點(diǎn)和抗逆性的互補(bǔ)有機(jī)組合?？梢允嵌喾N內(nèi)切酶的組合，也可以是內(nèi)切酶和外切酶的組合。組合酶應(yīng)用最常見的例子是有目的地選擇多種蛋白酶水解蛋白質(zhì)原料生產(chǎn)生物活性肽，根據(jù)蛋白質(zhì)原料的不同，幾種蛋白酶的要求不同；而目的肽的不同，幾種蛋白酶的選擇也不一樣。

飼料組合酶是酶制劑應(yīng)用技術(shù)體系的一個技術(shù)創(chuàng)新。飼料組合酶一般應(yīng)具備四個方面的特性：①催化水解同一底物酶的來源多樣性（在一定程度體現(xiàn)經(jīng)濟(jì)性）；②酶的催化反應(yīng)的配合性（催化水解位點(diǎn)的不同和配合）；③酶最適條件和抗逆特性的互補(bǔ)性；④酶的應(yīng)用效果的高效性。飼料組合酶最終反映在解決催化飼料復(fù)雜底物的高效性問題。從嚴(yán)格意義上講，設(shè)計(jì)和開發(fā)生產(chǎn)飼料組合酶應(yīng)考慮這些特性，組合酶不是多種催化水解同一底物酶的簡單混合，而是根據(jù)各自酶學(xué)特性的有機(jī)組合。

一般地，與常見的單酶與復(fù)合酶相比，科學(xué)合理的組合酶應(yīng)考慮作用底物更有針對性、多種酶源的配合及互補(bǔ)和催化作用更加高效性。組合酶在飼料中應(yīng)用的最大好處就是在酶的催化環(huán)境條件不理想的情況下，發(fā)揮其配合作用，從而達(dá)到高效能的目的。

如果考慮復(fù)合酶的作用同時，又要考慮組合酶的效果，可以配制應(yīng)用組合型復(fù)合酶制劑（Combinative&Complex Enzymes）。一個典型的組合型復(fù)合酶制劑產(chǎn)品應(yīng)該包括催化水解多種底物，而且催化水解同一底物的酶制劑有幾種來源不同的單酶組成，例如，應(yīng)用大量雜粕和麥類的非常規(guī)原料的日糧，可以設(shè)計(jì)含有真菌木聚糖酶、細(xì)菌木聚糖酶、木霉纖維素酶和青霉纖維素酶等組成的組合型復(fù)合酶制劑。

目前酶制劑產(chǎn)品開發(fā)仍然比較混亂，其中一個方面就是不同企業(yè)產(chǎn)品酶活之間沒有可比性，只是籠統(tǒng)標(biāo)明各種酶的活性，例如一個典型復(fù)合酶產(chǎn)品的例子，仔豬日糧專用酶：木聚糖酶(180000 U/g)、β-葡聚糖酶(25000 U/g)、纖維素酶(11000 U/g)、果膠酶(400 U/g)、淀粉酶(2000 U/g)、酸性蛋白酶(3000 U/g)，添加量為50～100 g/t。木聚糖酶活性180000 U/g是高還是低？比另一企業(yè)產(chǎn)品的木聚糖酶活性120000 U/g是更好嗎？不能簡單評判。

組合酶的另一個作用是可以部分解決不同企業(yè)產(chǎn)品酶活之間可比性問題。組合酶的成分一般都要注明酶的來源，例如，小麥-雜粕型日糧專用組合型液體酶：哈茨木霉木聚糖酶(450000 U/g)、藍(lán)狀菌木聚糖酶(350000 U/g)、纖維桿菌纖維素酶(300000 U/g)，嗜松青霉纖維素酶(350000 U/g)，添加量為80～100 g/t。由于明確了酶的來源，酶活的意義就能夠比較容易規(guī)范。

在上述的小麥-雜粕型日糧專用組合型液體酶配方中，考慮了木聚糖降解酶間的協(xié)同作用。木聚糖降解酶的同型協(xié)同作用已經(jīng)在藍(lán)狀菌（Talaromyces byssochlamydoides）(Yoshioka等，1981) 和哈茨木霉（Trichoderma harzianum）(Wong等，1986)中得到了很好的驗(yàn)證。

3 提出新型飼料組合酶的理論基礎(chǔ)

3.1 催化降解同一底物的酶來源很多，它們之間的催化功能既有可替代的、也有不可以替代的。這樣，可替代性就有更多的選擇性，對整體降低應(yīng)用成本有好處；不可替代性就存在著互補(bǔ)性，對真正發(fā)揮酶的最大效率有好處。例如，蛋白酶有來源于動物、植物和微生物的蛋白酶，而動物、植物和微生物蛋白酶又分別有許多種。同樣，植酸酶有來源于微生物、植物和動物的植酸酶，Dvorakova（1998）綜述了3類植酸酶的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)特征。纖維素酶和木聚糖酶多由細(xì)菌和真菌產(chǎn)生，此類微生物包括：需氧性微生物（aerobes）、厭氧性微生物（anaerobes）、嗜溫微生物（mesophiles）、嗜熱微生物（thermophiles）和極溫微生物（extremophiles）。耐超高溫的微生物[如棲熱袍菌屬（thermotoga sp.）、激烈熱球菌（pyrococcus furiosus）和熱絲菌屬（thermofilum sp.）]能生長在 85～110 ℃環(huán)境中，并能產(chǎn)生極其穩(wěn)定的分解纖維素和半纖維素的酶（Simpson等，1991；Antranikian，1994；Witerhalter等，1995）。細(xì)菌纖維素酶有多種不同水解纖維素的機(jī)理，例如耗氧菌[纖維桿菌屬（Cellulomonas）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）、嗜熱放線菌（Thermoactinomycetes）、褐色高溫單胞菌（T.Fusca）、細(xì)小雙孢子菌（Microbispora）]和糞堆梭菌（C.stercorarium）產(chǎn)生的纖維素分解酶系，有點(diǎn)類似于耗氧真菌產(chǎn)生的纖維素分解酶，這些纖維素分解酶系通過不同酶組分的相互協(xié)作來降解纖維素（Beguin 等 ，1992；Wood，1992；Gilbert 和 Hazlewood，1993）。植酸酶可以大致分成6-植酸酶和3-植酸酶兩類。這種分類是根據(jù)植酸分子水解的起始位點(diǎn)而劃分的，6-植酸酶多來源于植物，3-植酸酶是由真菌（Aspergillum sp.）產(chǎn)生的（Dvorakova，1998）。

3.2 不同來源酶的酶學(xué)性質(zhì)是不同的，它們催化降解的位點(diǎn)不同，有些是外切酶，有些是內(nèi)切酶。有目的互補(bǔ)組合，能夠發(fā)揮各自性能，配合而達(dá)到最佳的作用效果。例如，木聚糖酶對多聚木聚糖的內(nèi)部β-1,4鍵有活性，這種木聚糖酶稱為內(nèi)切木聚糖酶。根據(jù)其對不同多糖的活性，內(nèi)切木聚糖酶又可分為特異性和非特異性木聚糖酶（Coughlan，1992；Coughlan等，1993）。特異性內(nèi)切木聚糖酶僅對木聚糖的β-1,4鍵有活性，而非特異性內(nèi)切木聚糖酶可以水解以β-1,4鍵連接的木聚糖、混合木聚糖的β-1,4鍵及其他β-1,4連接的多糖，如CM-纖維素。大多數(shù)內(nèi)切木聚糖酶能特異性地作用于木聚糖的非取代木糖苷鍵，并釋放取代的和非取代的木寡糖。相反，其他內(nèi)切木聚糖酶特異性作用于在主鏈上的接近取代基團(tuán)的木糖苷鍵。例如，來源于黑曲霉（Aspergillus niger）的兩種酶（PI 8.0和9.6）對去掉阿拉伯糖取代基的木寡糖和木聚糖表現(xiàn)很小活性或沒有活性（Frederick等，1985）。對混合木聚糖（具有 β-1,3、β-1,4鍵的 rhodymenan）作用的大多數(shù)內(nèi)切葡聚糖酶能特異地作用于β-1,4鍵（Coughlan，1992）。同時，內(nèi)切木聚糖酶除了能降解主鏈外，還可根據(jù)其能否降解支鏈釋放阿拉伯糖而分為兩類（Coughlan 等，1993）。

3.3 如果飼料成分復(fù)雜底物，特別是非淀粉多糖的降解需要多種酶之間協(xié)同作用。二個或更多的酶之間的有效配合，其作用效果好于單一添加任何一種酶制劑的疊加作用，這種現(xiàn)象就是協(xié)同作用。Giligan等（1954）在水解纖維素的過程中，首次證實(shí)了不同纖維素酶間的協(xié)同增效作用。類似的幾項(xiàng)研究驗(yàn)證了在晶體纖維素的溶解過程中，內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶之間的協(xié)同作用（Wood，1988；Klyosov，1990；Bhat，1994）。有報(bào)道在真菌纖維素酶中存在五種協(xié)同作用：①內(nèi)切葡聚糖酶和一種稱為C1的非水解蛋白間的協(xié)同作用（Reese等，1950）；②β-葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶或者CBH之間的協(xié)同作用（Eriksson等，1985）；③兩個免疫學(xué)上相關(guān)的或截然不同的CBH之間的協(xié)同作用（Wood等，1986）；④源自相同或不同微生物內(nèi)切葡聚糖酶和CBH之間的協(xié)同作用（Wood等，1989）；⑤兩種內(nèi)切葡聚糖酶之間的協(xié)同作用（Klyosov，1990）。另外，細(xì)菌纖維素酶和真菌纖維素酶之間也有協(xié)同作用，來自嗜熱纖維素單胞菌（C.thermocellum）的多酶復(fù)合體的亞基之間存在協(xié)同作用（Bhat等，1994；Wood 等，1994）。Coughlan 等（1988）、Wood（1988）以及 Klyosov（1990）等深入地研究了來自真菌的纖維素酶之間的協(xié)同作用。大部分的協(xié)同模式有：①內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶間的協(xié)同作用；②外切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶之間的協(xié)同作用；③內(nèi)切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶之間的協(xié)同作用。Wood等（1972）認(rèn)為，被內(nèi)切纖維素酶裂解的纖維素鏈可以變成外切纖維素酶的底物，兩種酶相互協(xié)同降解纖維素。但是該模型不能解釋兩種不同CBHs間的協(xié)同作用、或者CBH不能與來自不同微生物的內(nèi)切葡聚糖酶相互協(xié)同作用的現(xiàn)象。因此，使用高純度的內(nèi)切葡聚糖酶和來自嗜松青霉(P.pinophium)的CBHs的研究表明，只有兩種內(nèi)切葡聚糖酶（EGⅢ和EGⅤ）對纖維素具有很強(qiáng)的吸附性，與CBHsⅠ和CBHsⅡ有協(xié)同作用（Wood等，1989）。他們認(rèn)為，在CBHsⅠ和Ⅱ與內(nèi)切葡聚糖酶之間的協(xié)同作用，是因?yàn)檫@兩類酶間的不同立體空間結(jié)構(gòu)造成的。有效而徹底的分解木聚糖需要有不同特性的主鏈裂解酶和支鏈裂解酶的協(xié)同作用（Coughlan 等，1993；Coughlan 等，1993）。對于木聚糖降解酶來講，因?yàn)榈孜飦碓吹奶烊徊町悾詢H衡量產(chǎn)生的還原糖量，不足以證實(shí)其協(xié)同作用。因此，必須分離和純化，并進(jìn)行定性、定量分析其分解產(chǎn)物，以獲得木聚糖降解酶協(xié)同作用的更為清晰的資料。事實(shí)上兩種酶之間的協(xié)同作用模式有三種類型：①同型協(xié)同；②異型協(xié)同；③抗協(xié)同（Coughlan等，1993）。同型與異型協(xié)同可能有一種或二種產(chǎn)物。同型協(xié)同可以是在二種或多種的側(cè)鏈裂解酶之間的協(xié)同，也可能是在二種或多種的主鏈裂解酶之間的協(xié)同（Coughlan等，1993）。同樣，植酸水解為肌醇的全部過程已經(jīng)確定，已經(jīng)清楚，沒有哪一個單獨(dú)的酶能水解植酸分子中所有的磷酸，因此，整個水解過程是在很多非特異性酶的聯(lián)合作用下完成的（Maenz，2004）。

3.4 在一定條件下（特定的作用環(huán)境和時間），某一種酶數(shù)量或活性進(jìn)一步增加并不能提高催化性能，各種酶和對應(yīng)的底物濃度的反應(yīng)基本動力學(xué)是米氏方程（陳石根等，2001）。而不同來源作用同一種底物的酶的米氏方程不一樣（陳芳艷，2010）。

3.5 同一類酶而來源不同其最適條件差異很大。不同菌屬來源、不同發(fā)酵方式生產(chǎn)的纖維素酶在酶系組成及酶學(xué)特性上存在差異（孟雷等，2002）。絕大多數(shù)來自真菌的內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的分子量均在20～100 kDa的范圍內(nèi)，而β-葡萄糖苷酶的分子量范圍為50～300 kDa。通常情況下，來自真菌的酶活性的最佳pH值在4.0～6.0之間，而來自細(xì)菌的酶的最佳活性pH值為6.0～7.0之間（Wood，1985）。來自嗜溫（mesophilic）真菌和細(xì)菌的內(nèi)切葡聚糖酶、CBHs和β-葡萄糖苷酶的最佳活性溫度是40～55℃（Wood等，1988；Bhat等，1989；Christakopoulos等，1994），而來自嗜溫和嗜熱微生物的纖維素酶的最佳活性溫度分別為 60～80 ℃和 90～110 ℃（Khandke等，1989；Bhat等，1993；Antranikian，1994）。在黃燕華（2004）的試驗(yàn)中三種纖維素酶分別來自木霉固體發(fā)酵、木霉液體發(fā)酵和青霉液體發(fā)酵，三種酶的組分和酶學(xué)特性都存在差異。三種不同來源的纖維素酶在相同測定條件下其酶活差別較大。由于不同來源的酶活性上的差別，在實(shí)際應(yīng)用中以重量比來添加，顯然會造成使用效果差異較大。不同來源的纖維素酶雖然作用相同，但具有不同的最適pH值和溫度，因此，用同一種測定方法測定不同來源的纖維素酶得到的酶活值尚不能完全具有代表性。

3.6 同一類酶而來源不同其熱穩(wěn)定性差異很大。例如：經(jīng)80℃高溫處理1～3 min后，三種纖維素酶的剩余酶活差異較大；其中，青霉液體發(fā)酵的酶的熱穩(wěn)定性較好，剩余酶活仍保留了94.8%。而木霉固體發(fā)酵酶和木霉液體發(fā)酵酶熱穩(wěn)定性較差（黃燕華，2004）。

3.7 同一類酶而來源不同其對于胃腸道的蛋白水解酶的耐受性差異很大。對于畜禽胃腸道環(huán)境的穩(wěn)定性最終決定外源酶制劑的應(yīng)用效果，只有在消化道內(nèi)能保留足夠的活性，存留足夠的時間，酶制劑才能發(fā)揮應(yīng)有的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在消化道環(huán)境中對于3種纖維素酶，木霉液體發(fā)酵酶的穩(wěn)定性最好，木霉固體發(fā)酵酶最差（黃燕華，2004）。另外，在體外試驗(yàn)中胃蛋白酶對木霉固體發(fā)酵酶影響最大，木霉液體發(fā)酵酶耐受性較好。

3.8 來源于不同飼料中的一些離子對同一類酶的活性影響差異很大。如我們的研究發(fā)現(xiàn)：Fe2+、Zn2+和Ca2+對3種纖維素酶的CMCase和FPase活性均有抑制作用，但抑制作用都不顯著，只有木霉液體發(fā)酵酶的CMCase活性受Ca2+影響較大；Mn2+對3種纖維素酶的CMCase和FPase活性均有激活作用；Cu2+對3種纖維素酶的CMCase活性有激活作用，但對其FPase活性則是抑制作用，其中木霉液體發(fā)酵酶受影響最大；Mg2+對3種纖維素酶的作用出現(xiàn)了差異，它使青霉液體發(fā)酵酶的CMCase和FPase活性提高，而使木霉固體發(fā)酵和木霉液體發(fā)酵酶的CMCase和FPase活性降低，其中，木霉液體發(fā)酵酶的FPase活性受影響較大（黃燕華，2004）。離子對酶活抑制或激活影響的不一致，可能是因?yàn)椴煌瑏碓吹睦w維素酶需用作電子載體的特定金屬離子不同造成的。

4 飼料組合酶的設(shè)計(jì)技術(shù)

4.1 差異性篩選技術(shù)

組合酶的篩選首先需要明確作用于同一底物的多個酶不是同一種酶，如木聚糖酶有內(nèi)切酶和外切酶（蘇玉春，2008）、植酸酶有3-植酸酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC 3.1.3.26)（付大偉，2010）等。為確定組合酶組合篩選的對象為不同的酶，可采取以下4種方法進(jìn)行區(qū)分：①蛋白分子特性的差異性篩選。如Sapag等（2002）研究了26個來源的木聚糖酶，通過比較長度、分子量和等電點(diǎn)可發(fā)現(xiàn)其中哪些是同種酶（見表1）。其中，通過電泳的方式測定酶蛋白的分子量最直接、簡單和快捷，如我們課題組在2004年從市場上采集了2個企業(yè)的木聚糖酶，通過電泳發(fā)現(xiàn)真菌性木聚糖酶和細(xì)菌性木聚糖酶的分子量分別為23.65和24.45 kDa，屬于不同的木聚糖酶（于旭華，2004）。②不同來源酶的氨基酸組成和含量。如于旭華（2004）比較了6個來源的木聚糖酶，發(fā)現(xiàn)其氨基酸組合和含量上有明顯差異（見表2）。③米氏常數(shù)的比較。如陳芳艷（2010）對蛋白修飾改造之后谷胱甘肽過氧化物酶與修飾前的米氏常數(shù)比較發(fā)現(xiàn)分別為1.484 mmol/l和0.2857 mmol/l。④對酶蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。如采用X-ray衍生技術(shù)分析到的瘤胃微生物植酸酶（郭瑞庭等，2004）、大腸桿菌植酸酶（Liu等，2004；Xiang等，2004）和芽孢桿菌植酸酶（Ha等，2000；Shin等，2001）的空間結(jié)構(gòu)分別見圖 1、2、3。

表1 不同微生物來源木聚糖酶的蛋白質(zhì)分子特性

表2 3#真菌木聚糖酶和4#細(xì)菌木聚糖酶氨基酸組成和含量（%）

圖1 瘤胃微生物植酸酶

圖2 大腸桿菌植酸酶

圖3 芽孢桿菌植酸酶

4.2 互補(bǔ)性篩選技術(shù)

差異性是組合酶組合篩選的基本條件，而不同單酶的差異性則是組合酶組合篩選的基本要求。為確定組合酶組合篩選的對象之間的互補(bǔ)性，可根據(jù)酶最適條件和抗逆特性進(jìn)行篩選：①酶最適條件的互補(bǔ)性。如于旭華（2004）比較分別來源細(xì)菌和真菌的木聚糖酶耐熱性，發(fā)現(xiàn)真菌性木聚糖酶3#在30～50℃之間具有比細(xì)菌性木聚糖酶4#更高的活性，而在50～80℃則相反，理論上兩者組合具有充分利用腸道和加工過程中多個水解位點(diǎn)的組合增效性；而酸性植酸酶在pH值2～4.5條件下具有比中性植酸酶更高的酶活，而在pH值4.5～7.0條件下則相反，具有在不同pH值條件下的互補(bǔ)性（李春文，2007）。②抗逆特性的互補(bǔ)性。如于旭華（2004）在比較木聚糖酶對Ca2+濃度耐受性發(fā)現(xiàn)，真菌性木聚糖酶在低Ca2+濃度條件下具有較高的活性，而細(xì)菌性木聚糖酶在高Ca2+濃度條件下具有較高的活性；而黃燕華（2004）比較三個來源的纖維素酶對胃蛋白酶和胰蛋白酶耐受性的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，纖維素酶B在胃蛋白酶處理?xiàng)l件下具有最高活性，而纖維素酶C在胰蛋白酶處理?xiàng)l件下具有最高的活性。

4.3 組合酶篩選的基本方法

在差異性和互補(bǔ)性篩選的基礎(chǔ)上，組合增效才是組合篩選的最終目的。根據(jù)前兩部分的工作，我們歸納出，一般組合酶組合篩選的思路可選擇內(nèi)切+外切、中性+酸性及真菌性+細(xì)菌性3種。在此基礎(chǔ)上，篩選的方法可以以組合之后提高產(chǎn)物的降解效率、組合提高酶的活力、組合提高降解原料的效率、體內(nèi)和體外消化代謝試驗(yàn)、飼養(yǎng)試驗(yàn)等。其中，在以中性+酸性的模式篩選組合蛋白酶時發(fā)現(xiàn)，相對單酶，中性和酸性蛋白酶以3：7的比例組合可顯著提高豆粕總水解度、可溶性蛋白水解度和蛋白浸出率（曾謹(jǐn)勇，2010；雷建平，2010），而且可提高豆粕降解產(chǎn)物中小肽的含量；內(nèi)切+外切篩選技術(shù)方面，Wood等（1989）發(fā)現(xiàn)，來自嗜松青霉(P.pinophlum)的CBHS（外切葡聚糖纖維二糖水解酶）（Ⅰ和Ⅱ型）與內(nèi)切葡聚糖酶（EⅠ至EⅤ）之間在水解棉花纖維上具有顯著的協(xié)同作用；真菌性+細(xì)菌性篩選技術(shù)方面，我們最近選擇了4種不同來源的木聚糖酶，其中真菌性木聚糖酶A+細(xì)菌性木聚糖酶C按3：7組合，顯著提高了降解木聚糖、小麥的效率，并在后期肉雞飼養(yǎng)試驗(yàn)中也表現(xiàn)出相對單酶更高的生長性能；此外，張民（2010）選用組合木聚糖酶、真菌酸性木聚糖酶、真菌中性木聚糖酶、細(xì)菌中性木聚糖酶進(jìn)行蛋雞的飼養(yǎng)試驗(yàn)表明，添加1：1：1組合的木聚糖酶對產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率和降低料蛋比的影響顯著優(yōu)于不同來源的單一木聚糖酶。

5 飼料組合酶應(yīng)用的價(jià)值和意義

組合酶產(chǎn)品并不是一個完全新的產(chǎn)品，已經(jīng)有少量飼料酶制劑產(chǎn)品初步具有組合酶的特性。但是，總體而言，開發(fā)應(yīng)用組合酶或組合型復(fù)合酶還很少，有意識、專門化設(shè)計(jì)生產(chǎn)組合酶或組合型復(fù)合酶就更少。組合酶有別于傳統(tǒng)上的復(fù)合酶，作為一個專門類別的新型酶制劑進(jìn)行討論，規(guī)范和完善它的概念、特性和作用還是第一次，其目的是為了強(qiáng)調(diào)它的重要性和應(yīng)用前景。目前，飼料組合酶的應(yīng)用主要有如下幾方面的價(jià)值。

5.1 催化同一底物而來源不同的酶的價(jià)格是不同的，互相組合，可以利用一些來源方便，商業(yè)生產(chǎn)成本比較低的酶制劑，再結(jié)合一些相對成本高、而作用能夠互補(bǔ)的酶制劑，在保證酶添加使用效果的情況下，整體降低飼料酶制劑添加劑的使用成本，有利于酶制劑添加劑推廣使用。

5.2 飼料生產(chǎn)成本的問題，相當(dāng)程度是由于原料成本上漲造成的，開發(fā)和有效利用非常規(guī)飼料原料是關(guān)鍵。非常規(guī)飼料原料主要是由于含有一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響了它們的高效利用。目前處理非常規(guī)飼料原料往往使用一些專門的酶制劑，但是由于一些非常規(guī)飼料原料成分和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，一般的單酶或者復(fù)合酶并不能有效的解決其利用效率的問題。組合酶或組合型復(fù)合酶由于其酶種來源及其互補(bǔ)和協(xié)同特性，在理論上具有比一般單酶或復(fù)合酶的酶學(xué)特性的優(yōu)勢，能夠發(fā)揮其快速高效作用的潛能。因此，組合酶或組合型復(fù)合酶在提高非常規(guī)飼料原料日糧的利用效率、有效地開發(fā)非常規(guī)飼料原料資源等方面具有巨大的潛力。

5.3 一些畜禽由于種類和生長階段、消化生理特性的關(guān)系，不能很好地利用人工配制的日糧，特別是日糧中含有較多的植物性成分和一些難于利用的成分，使一些飼料產(chǎn)品的質(zhì)量低且不穩(wěn)定。例如，仔豬對大豆蛋白的抗原性問題、谷物抗性淀粉利用問題、水產(chǎn)動物對植物蛋白利用問題、寵物對植物成分利用問題等。人們嘗試開發(fā)的一些所謂特別飼料，例如，早期的豬禽無魚粉配方、仔豬無乳制品日糧、低魚粉或無魚粉水產(chǎn)飼料、甚至最近的豬禽無玉米、豆粕日糧，等等，盡管有成功的例子，但廣泛應(yīng)用不多，當(dāng)然因素很多，其中一個重要的因素是處理好動物的消化生理和日糧成分的特性關(guān)系。解決動物的消化生理和日糧成分的特性關(guān)系問題的一個措施是應(yīng)用飼料酶制劑。但是，在開發(fā)上述飼料產(chǎn)品，人們普遍考慮了酶制劑，甚至使用了一些專門的酶制劑或強(qiáng)化了用量，而通常效果并不理想。如果我們利用組合酶或組合型復(fù)合酶互補(bǔ)性和協(xié)同特性，有針對性開發(fā)特種動物專用或者特種類型日糧專用的組合酶或組合型復(fù)合酶，組合酶或組合型復(fù)合酶有可能為部分或全部解決這些問題提供一種有效措施。

應(yīng)用組合酶添加劑的前提是日糧中存在大量復(fù)雜的大分子、難分解的營養(yǎng)或抗?fàn)I養(yǎng)成分底物，需要多種針對同一底物的酶配合完成水解任務(wù)。相反，有一些相對容易分解的底物，可能一種酶就可以完成有效的催化任務(wù)，就沒有必要一定使用組合酶。所以，從應(yīng)用成本角度，應(yīng)用飼料酶的總原則是：可以應(yīng)用單酶（單一酶）添加劑基本解決問題的，就不要使用組合酶或復(fù)合酶添加劑；可以應(yīng)用復(fù)合酶添加劑基本解決問題的，就不要使用組合型復(fù)合酶添加劑。

組合酶與廣泛應(yīng)用的復(fù)合酶的目的意義是不同的，飼料復(fù)合酶的特點(diǎn)是解決催化多種飼料成分底物的問題；而飼料組合酶的最大特點(diǎn)是解決催化飼料成分底物的高效性問題。目前，飼料酶制劑應(yīng)用的最大問題就是高效性問題，特別是酶如何在飼料加工過程中能夠發(fā)揮作用，以及考慮在消化道的抗逆性，在短時間內(nèi)如何使酶的配合發(fā)揮最大效率的問題最突出。隨著非常規(guī)飼料原料的大量使用，高效的組合酶將更有優(yōu)勢。因此，今后飼料酶制劑的發(fā)展方向，應(yīng)該是研發(fā)和使用更多的組合酶或組合型復(fù)合酶產(chǎn)品。

[1]于旭華.真菌性和細(xì)菌性木聚糖酶對肉雞生長性能的影響及機(jī)理研究[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2004.

[2]付大偉.Yersinia spp.來源植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)與功能研究[D].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文，2010.

[3]馮定遠(yuǎn).飼料工業(yè)的技術(shù)創(chuàng)新與技術(shù)經(jīng)濟(jì)[J].飼料工業(yè)，2004（11）:1-6.

[4]張民，范仕苓，馬秋剛，等.不同來源的木聚糖酶及組合酶對產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能的影響[J].飼料工業(yè)，2010,31(6)：12-15.

[5]李春文.復(fù)合植酸酶對飼料中鈣磷體外消化率的影響 [D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科論文，2007.

[6]蘇玉春.木聚糖酶的酶學(xué)特性及基因克隆表達(dá)研究 [D].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文,2008.

[7]陸健，曹鈺，陳堅(jiān)，等.米曲霉RIBI28耐酸性木聚糖酶的研究[J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，20(6):608-611.

[8]陳石根，周潤琦.酶學(xué)[M].上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，2001：166-176.

[9]陳芳艷.豬谷胱甘肽過氧化物酶的修飾及生物活性研究 [D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2010.

[10]孟雷，陳冠軍，王怡，等.纖維素酶的多型性[J].纖維素科學(xué)與技術(shù)，2002（2）:47-54.

[11]黃燕華.不同來源纖維素酶的酶學(xué)特性及其在馬岡鵝中的應(yīng)用[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2004.

[12]曾謹(jǐn)勇.中性蛋白酶不同比例對豆粕蛋白水解效果的影響[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科論文，2010.

[13]雷建平.不同中性蛋白酶水解豆粕多肽最佳組合的篩選[D].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科論文，2010.

[14]Antranikian G.Extreme thermophilic and hyperthermophilic microorganisms and their enzymes [M].Advanced Workshops in Biotechnological on Extremophilic Microorganisms,NTUA,A－thens,Greece,1994：1-30.

[15]Beguin P,Millet J,Chauvaux S,et al.Bacterial cellulases[J].Biochemical Society Transactions,1992，20:42-46.

[16]Bhat K M,McCrae S I,Wood T M.The endo- (1-4)-0-D-glucanase system of Penicillium pinophilum cellulase:isolation,purification and characterization of five major endog1ucanase components[J].Carbohydrate Research,1989,190:279-297.

[17]Bhat S,Goodenough P W,Bhat M K,et al.Isolation of four major subunits from Clostridium thermocellum cellulosome and their synergism in the hydrolysis of crystalline cellulose [J].International Journal of Biological Macromolecules,1994，16:335-342.

[18]Bhat K M,Gaikwad J S,Maheshwari R.Purification and characterization of an extracellular β-glucosidase from the thermophilic fungus sporotrichum thermophile and its influence on cellulase activity[J].Journal of General Microbiology,1993,139:2825-2832.

[19]Christakopoulos P,Goodenough P W,Kekos D,et al.Purification and characterization of an extracellular β-glucosidase with transglycosylation and exoglucosidase activities from Fusarium oxysporum[J].European Journal of Biochemistry,1994,224:379-385.

[20]Coughlan M P,Ljungdahl L G.Comparative biochemistry of fungal and bacterial cellulolytic enzyme systems[M]//Aubert J P,Beguin P,Millet J.(eds)Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation.FEMS Symposium No.43.Academic Press,London,1988:11-30.

[21]Coughlan M P,Tuohy M A,Filho E X F,et al.Enzymological aspects of microbial hemicellulases with emphasis on fungal systems[M]//Coughlan M P,Hazlewood G.P.(eds.)Hemicellulose and Hemicellulase.Portland Press,London,1993:53-84.

[22]Coughlan M P,Hazlewood G.P.P-l,4-D-Xylan--degrading enzyme systems:biochemistry,molecular biology and applications[J].Biotechnology and Applied Biochemistry,1993,17:259-289.

[23]Coughlan M P.Towards an understanding of the mechanism of action of main chain-hydrolysing xylanases[M]//Visser,J.,Beld－man,G.,Kusters-van Someren,M.A.and Voragen,A.G.J.(eds)Xylans and Xylanases.Progress in Biotechnological,Elsevier,Amsterdam,The Nether1ands,1992:111-139.

[24]Dvorakova J.Phytase:sources,preparation and exploitation[J].Folia Microbiology,1998,43:323-338.

[25]Eriksson K E,Wood T M.Biodegradation of cellulose[M]//Higuchi,T.(ed.)Biosynthesis and Biodegradation of Wood Components,Academic Press,New York,1985:469-503.

[26]Frederick M M,Xiang C H,Frederick J R,et al.Purification and characterization of endo-xylanases from Aspergillus nicer.I.Two isozymes active on xylan backbones near branch points[J].Biotechnology and Bioengineering,1985,27:525-528.

[27]Gilbert H J,Hazlewood G.P.Bacterial cellulases and xylanases[J].Journal of General Microbiology,1993,139:187-194.

[28]Giligan W,Reese E T.Evidence for multiple components in microbial cellulases[J].Canadian Journal Microbiology,1954,1:90-07.

[29]Ha N C,Oh B C,Shin S,et al.Crystal structures of a novel,thermostable phytase in partially and fully calcium-loaded states[J].Nature Structural&Molecular Biology,2000,7:147-153.

[30]Khandke K M,Vithayathil P J,Murthy S K.Purification of xylanase,β-glucosidase,endocellulase,and exocellulase from a thermophilic fungus,Thermoascus aurantiacus[J].Archives biochemistry and Biophysics,1989,274:491-500.

[31]Klyosov A.Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation[J].Biochemistry,1990,29:10577-10585.

[32]Liu Q,Huang Q,Lei X G,et al.Crystallographic snapshots of Aspergillus fumigatus phytase,revealing its enzymatic dynamics[J].Structure,2004,12:1575-1583.

[33]Maenz D D.Properties of phytase enzymology in animal feed[M]//Bedford,M.R.and Partridge,G.G.(editors),Enzymes in Farm Animal Nutrition.CABI publishing,United Kingdom,2001:66-79.

[34]Marquardt R R,M.Bedford.Future trends in enzyme research for pig appplications.In:Enzymes in Farm Animal Nutrition[M].Marquardt,M.R.and G.G.Bedford(Eds).Finnfeeds International,Wiltshire,United Kingdom.Published by CAB International,2001:299-305.

[35]Rani D S,Nand K.Purification and Characterisation of Xylanolytic Enzymes of a Cellulase-free Thermophilic strain of Anaerobe Clostridiumabsonum CFR-702[J].Anaerobe,2001,7:45-53.

[36]Reese E T,Si R G.H,Levinson H S.The biological degradation of soluble cellulose derivatives and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis [J].Journal Bacteriology,1950,59:485-497.

[37]Sapag A,J.Wouters,C.Lambert,et al.Eyzaguirre and E.Depiereux,The endoxylanases from family 11:computer analysis of protein sequence reveals important structural and phylogenetic relationship[J].Journal of Biotechnology,2002,95:109-131.

[38]Shin S,Ha N C,Oh B C,et al.Enzyme mechanism and catalytic property of beta propeller phytase[J].Structure,2001,9:851-858.

[39]Simpson H D,Haufler U R,Daniel R M.An extremely thermostable xylanase from the thermophilic eubacterium Thermotogd[J].Biochemical Journal,1991,277:413-417.

[40]Witerhalter C,Liebl W.Two extremely thermostab1e xylanases of the hyperthermophilic bacterium Thermotogd mdritimd MSB8[J].Applied and Environmental Microbiology,1995,61:1810-1815.

[41]Wong K Y,Tan L U L,Saddler J N.Functional interactions among three xylanases from Trichoderma harzianum [J].Enzyme and Microbial Technology,l986,8:617-622.

[42]Wood T M,McCrae S I.The cellulase of Penicillium pinophilum:synergism between enzyme components in solubilizing cellulose with special reference to the involvement of two immunologically distinct CBHs[J].Carbonate Research,1986,234:93-99.

[43]Wood T M.Properties of cellulolytic enzyme systems [J].Biochemical Society Transactions,1985,13:407-410.

[44]Wood T M.Preparation of crystalline,amorphous,and dyed cellulase substrates[M]//Wood W A,Kellogg S T.(eds).Methods in Enzymology.VO1.160.Academic Press,London,1988:19-25.

[45]Wood T M.Microbial enzymes involved in the degradation of the cellulose component of plant cell walls[M]//Rowett Research Institute Annual Report,1992:10-24.

[46]Wood T M,McCrae S I,Bhat K M.The mechanism of fungal cellulose action.Synergism between enzyme components of Penicillium pinophilum cellulose in solubilizing hydrogen bond ordered cellulose[J].Biochemical Journal,1989,260:37-43.

[47]Wood T M,McCrae S I,Wlson C,et al.Aerobic and anaerobic fungal celluloses with special reference to their mode of attack on crystalline cellulose [M]//Aubert J P,Beguin P,Millet J.(eds)Biochemistry and Genetic of Cellulose Deglutition.FEMS Symposium No.43,Academic Press,London,1988:31-52.

[48]Wood T M,Wlson C A,McCrae S I.Synergism between components of the cellulase system of the anaerobic rumen fungus Neocallimastix frontalis and those of the aerobic fungus Penicillin pinophilum and Trichoderma koningi in degrading crystalline cellulose[J].Applied Microbiology and Biotechnology,1994,41:257-261.

[49]Xiang T,Liu Q,Deacon A M,et al.Crystal structure of a heat-resilient phytase from Aspergillus fumigatus,carrying a phosphorylated histidine[J].Journal of Molecular Biology,2004,339:437-445.[50]Yoshioka H,Nagato N,Chavanich S,et al.Purification and properties of thermostable xylanase from Talaromyces by ssochlamydoides[J].Agricultural Biological Chemistry,1981,45:2425-2432.