嚴 偲，劉青梅，楊性民

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201300；2.浙江萬里學院寧波市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點實驗室，浙江 寧波 315100）

寧波水磨年糕屬地方著名傳統(tǒng)特產(chǎn)，是以粳米為原料，經(jīng)浸泡、水磨、壓榨、蒸粉、擠壓成型、冷卻等多道工序加工而成的一種傳統(tǒng)食品，口感爽滑、韌性可口，深受消費者喜愛[1-2]。但由于年糕主要成分為淀粉，含水量和水分活度較高，很容易受到細菌和霉菌污染引起酸敗發(fā)霉，保質(zhì)期短。本試驗就年糕保鮮這一主題，運用 ε-聚賴氨酸[3]、溶菌酶[4]、乳酸鏈球菌素[5]、納它霉素[6]等高效生物防腐保鮮劑，以殼聚糖[7-8]為載體，對年糕進行涂膜保鮮。采用響應(yīng)面法（RSM），建立回歸方程模型，找出最優(yōu)組合，配制復合保鮮劑，降低年糕中腐敗微生物的含量，從而達到保鮮的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料與試劑 年糕：寧波慈城馮恒大年糕廠；菌落計數(shù)、孟加拉紅培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；ε-聚賴氨酸、乳酸鏈球菌素、納它霉素：中國銀象生物工程有限公司；溶菌酶：Sigma公司；甘氨酸：國藥集團化學試劑有限公司；殼聚糖：寧波市鎮(zhèn)海海鑫生物制品有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 手提式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械有限公司；BLON-8型無菌均質(zhì)器：上海比朗儀器有限公司；DZ-400真空包裝機：上海青葩食品包裝機械有限公司；SPX型智能生化培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗 以1%殼聚糖為載體，試驗分別采用 ε-聚賴氨酸（ε-PL）+0.01%醋酸[9]、溶菌酶+6%甘氨酸[4]、乳酸鏈球菌素（Nisin）、納它霉素溶液浸涂年糕，研究ε-PL、溶菌酶、Nisin對年糕中細菌的抑制作用效果以及納它霉素對年糕中霉菌和酵母的抑制作用效果。

1.2.2 復合因子響應(yīng)面試驗 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，應(yīng)用RSM原理，采用中心組合設(shè)計（CCD）,選取 ε-PL、溶菌酶、Nisin 三個因素為自變量，分別用A、B、C表示，每個因素取5個水平，以抑菌率為響應(yīng)值設(shè)計。試驗因素水平編碼見表1。采用Design Expert 7.0軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

表1 因素水平編碼 （%）

1.2.3 微生物檢測方法 菌落總數(shù)的測定：參照國標GB/T 4789.2-2010；霉菌和酵母計數(shù)：參照國標GB/T 4789.15-2010；抑菌率=（lg對照樣品菌落總數(shù)－lg保鮮樣品菌落總數(shù)）/lg對照樣品菌落總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 ε-PL對年糕中細菌的抑制作用 由圖1可以看出，ε-PL對年糕中的細菌抑制效果明顯，隨著ε-PL濃度的增加，菌落總數(shù)明顯減少，二者呈正相關(guān)關(guān)系；當ε-PL濃度大于0.2%時，ε-PL對年糕中細菌的抑制作用不再明顯。

圖1 不同濃度ε-聚賴氨酸對年糕中細菌的抑制效果

2.1.2 溶菌酶對年糕中細菌的抑制作用 由圖2可以看出，溶菌酶對年糕中的細菌有著較好的抑制效果，當溶菌酶濃度達到0.05%時，抑制效果最好；濃度繼續(xù)增加，抑制效果反而不好，這與文 獻[4]報道中溶菌酶使用的最適濃度為0.05%保持一致，說明其在年糕等糕團食品中亦可使用。

圖2 不同濃度溶菌酶對年糕中細菌的抑制效果

2.1.3 乳酸鏈球菌素（Nisin）對年糕中細菌的抑制作用 由圖3可以看出，添加Nisin可以明顯抑制年糕中的細菌，當Nisin濃度達到0.02%時，抑制效果最顯著，這一結(jié)果與劉青梅等[2]研究結(jié)果一致。

圖3 不同濃度乳酸鏈球菌素對年糕中細菌的抑制效果

2.1.4 納它霉素對年糕中真菌的抑制作用 為了提高對年糕中霉菌的抑制作用，保證保鮮效果，試驗在配制復合保鮮液的過程中添加納它霉素，其對年糕中真菌的抑制作用的試驗效果見圖4。從圖4中可以看出，隨著納它霉素濃度的增加，霉菌和酵母計數(shù)結(jié)果亦隨之下降，當納它霉素濃度達到0.04%時，從菌落形態(tài)觀察，基本無霉菌生長，雖未能完全抑制酵母菌的生長，但年糕表面已無霉斑產(chǎn)生，考慮到納它霉素的添加劑量標準[10]，在本試驗中將納它霉素的添加量確定為0.04%。

圖4 不同濃度納它霉素對年糕中真菌的抑制效果

2.2 復合因子對年糕中細菌的抑制作用

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 試驗對年糕中細菌起主要抑制作用的三個因子（ε-PL、溶菌酶、Nisin）進行響應(yīng)面組優(yōu)化試驗，采用CCD設(shè)計，以抑菌率為響應(yīng)值進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 CCD設(shè)計方案及結(jié)果 （%）

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析 對表2中數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，獲得抑菌率的預測值對ε-PL、溶菌酶、nisin的二次多元回歸方程：

對回歸方程進行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗，結(jié)果見表3。

由方差分析可知：（1）此模型的P＜0.000 1，響應(yīng)面回歸模型達到高度顯著水平，其中決定系數(shù)R2=0.990 4，說明99%的試驗數(shù)據(jù)可以用此方程解釋，失擬項在0.01水平上不顯著，回歸模型的擬合程度較好，可以用此模型進行分析和預測。（2）回歸方程分析：一次項 A、B、C 均為 P＜0.000 1，說明 ε-PL、溶菌酶、Nisin這三個因子對抑菌率的影響都極其顯著，抑菌效果為ε-PL＞Nisin＞溶菌酶；AC交互項P值為 0.026 7，在0.01＜P≤0.05范圍內(nèi)，說明ε-PL和Nisin之間的交互作用顯著；同理，AB、BC對響應(yīng)值不顯著，說明ε-PL和溶菌酶之間的交互作用不顯著，溶菌酶和Nisin之間的交互作用不顯著。

2.2.3 響應(yīng)曲面和等高線圖解析 將一個因子固定在0水平，分析其余兩個因子間的交互作用對響應(yīng)值的影響，響應(yīng)曲面和等高線圖見圖5~7。響應(yīng)面回歸模型高度顯著，抑菌效果：ε-PL＞Nisin＞溶菌酶。

表3 響應(yīng)面二次回歸模型方差分析

圖5 Y=f（A，B）的響應(yīng)曲面（C=0.2）

圖6 Y=f（A，C）的響應(yīng)曲面（B=0.05）

由圖5可以看出，等高線曲率較小，形狀近似橢圓，說明ε-PL與溶菌酶之間存在著交互作用。當ε-PL的含量一定時，隨著溶菌酶含量的不斷增加，抑菌率先隨之增加，后又有所下降。這可能跟溶菌酶的特殊性有關(guān)，主要對革蘭氏陽性菌有溶菌作用，然而年糕中的腐敗菌不只是革蘭氏陽性菌，還有其他微生物。若溶菌酶濃度過大，與年糕表面接觸的ε-PL濃度就相對下降，抑菌效果反而不好。

圖7 Y=f（B，C）的響應(yīng)曲面（A=0.2）

由圖6可以看出，等高線曲率較小，形狀近似橢圓，說明ε-PL與Nisin之間存在著交互作用。又由顯著性檢驗結(jié)果（P＜0.05）可知，二者之間交互作用影響顯著。當ε-PL的含量一定時，Nisin濃度增加，抑菌率隨之增加；當Nisin含量增加到一定程度后，Nisin濃度繼續(xù)增加，抑菌率反而減小。這可能與ε-PL和Nisin的抑菌機理相關(guān)，二者均為從微生物發(fā)酵產(chǎn)物中提取合成的多肽化合物，ε-PL是通過靜電粘附于細胞膜表面，同時作用于蛋白和細胞膜的合成系統(tǒng)，與核糖體結(jié)合抑制蛋白和酶的合成，從而達到殺菌的目的[3]；Nisin是通過一個特別的對接分子附著在原生質(zhì)膜上，創(chuàng)造了一個由幾個Nisin分子組成的孔形成單位，這種相互作用導致細胞膜上形成暫時的氣孔，消除細胞的離子梯度，使細胞裂解死亡[11]。因此，一定濃度的ε-PL和Nisin復配，隨著Nisin濃度增加，可起到協(xié)同增效的作用，這與李誠等[3]研究結(jié)果是一致的。但當Nisin濃度過高時，與年糕表面接觸的ε-PL濃度就相對下降，抑菌效果也就隨之降低了。

由圖7可以看出，等高線形狀近似圓形，說明溶菌酶和nisin之間的交互作用不顯著。

2.3 復合保鮮劑最佳組合的確定

由軟件分析得出復合保鮮劑的的最佳組合：ε-PL為0.3%、溶菌酶為0.06%、Nisin為0.02%，理論最佳抑菌率為0.76。結(jié)合生產(chǎn)實際，考慮到溶菌酶成本等，將復合保鮮劑主要成分修正成ε-PL為0.3%、溶菌酶為0.05%、Nisin為0.02%，預測抑菌率為0.73。

采用修正后的復合保鮮劑組合做年糕保鮮的驗證試驗，重復3次，實測抑菌率為0.69，與理論預測值的相對誤差5%。

3 結(jié)論

（1）單因素試驗結(jié)果表明：ε-聚賴氨酸對年糕中細菌的抑制作用效果最為顯著，納它霉素對年糕中霉菌有較好的抑制作用。

（2）多因素試驗結(jié)果表明：三種保鮮劑對年糕的防腐保鮮效果為ε-PL＞Nisin＞溶菌酶。二次回歸模型分析（R2=0.990 4），表明模型擬合程度好。

（3）響應(yīng)曲面分析：ε-聚賴氨酸和Nisin之間等高線形狀近似橢圓，顯著性檢驗結(jié)果（P＜0.05），可見ε-聚賴氨酸和Nisin之間交互作用影響顯著，二者復配可起到協(xié)同增效的作用。ε-PL與溶菌酶之間等高線形狀近似橢圓，說明ε-PL與溶菌酶之間存在交互作用。溶菌酶和Nisin之間等高線形狀近似圓形，說明溶菌酶和Nisin之間的交互作用不顯著。

（4）綜合考慮，年糕復合保鮮劑成分為：殼聚糖1%、ε-聚賴氨酸0.3%、醋酸0.1%、溶菌酶0.05%、甘氨酸6%、乳酸鏈球菌素（Nisin）0.02%、納它霉素0.04%。該復合年糕保鮮劑預測抑菌率為0.73。實測抑菌率為0.69，與理論值相對誤差5%。

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