單治國(guó) 張春花 袁文俠 周紅杰*

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)·昆明·650201；2云南思茅師范高等?？茖W(xué)校·普洱·665000）

20世紀(jì)70年代以來(lái)，現(xiàn)代普洱茶（即普洱熟茶）加工工藝發(fā)展逐步成熟，發(fā)酵微生物接種方式分兩種[1]:一是人工渥堆快速發(fā)酵，即利用周圍環(huán)境中的微生物自然接種發(fā)酵生產(chǎn)普洱熟茶，這實(shí)際上是建立了一個(gè)復(fù)雜的多種微生物發(fā)酵體系。二是人工接種優(yōu)勢(shì)有益微生物進(jìn)行微生物固態(tài)發(fā)酵加工生產(chǎn)普洱熟茶[2]，此工藝將從普洱熟茶發(fā)酵體系中分離出的有益微生物，加以純化、快繁等處理，將純化的有益菌種按照一定的數(shù)量比接種于用于發(fā)酵的云南大葉種曬青毛茶，以發(fā)酵生產(chǎn)普洱熟茶，在這一生產(chǎn)過(guò)程中，結(jié)合人為控制固態(tài)發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵用菌量等技術(shù)措施，經(jīng)生產(chǎn)實(shí)踐證明，所加工出的普洱熟茶品質(zhì)優(yōu)良，耐泡性好，普洱熟茶的發(fā)酵周期也有一定程度的縮短。

所謂微生物固態(tài)發(fā)酵[3]是指在幾乎無(wú)自由水存在或有一定濕度的水不溶性固態(tài)基質(zhì)中，采用自然接種、人工接種或自然與人工接種相結(jié)合的方法，使用一種或多種微生物進(jìn)行發(fā)酵的一個(gè)生物反應(yīng)過(guò)程。這種固態(tài)基質(zhì)既提供微生物生長(zhǎng)代謝所需的碳源、氮源、礦物質(zhì)元素、水及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又提供微生物生長(zhǎng)的微環(huán)境。究其生物反應(yīng)過(guò)程的本質(zhì)，固態(tài)發(fā)酵是以氣相為連續(xù)相的生物反應(yīng)過(guò)程，適宜好氧微生物的生長(zhǎng)。固態(tài)發(fā)酵的基質(zhì)大多為不溶于水的物料，物料的水分含量低于12%時(shí)，微生物的生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制，固態(tài)發(fā)酵要控制物料的最低限含水量為12%。曬青毛茶一般含水量在9%～12%，必須增加茶葉含水量才能較好地發(fā)揮濕熱作用，增加水分必須根據(jù)茶葉老嫩、空氣溫度、空氣濕度、季節(jié)、固態(tài)發(fā)酵場(chǎng)地等不同情況，掌控發(fā)酵葉水分含量[4]。曬青毛茶經(jīng)潮水至必要的含水量，接種菌種后即可進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。在這種發(fā)酵環(huán)境中，茶葉就是發(fā)酵基質(zhì)[5]。

本文試對(duì)有益菌固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵因子進(jìn)行觀察記錄，探索其變化趨勢(shì)，并結(jié)合對(duì)發(fā)酵階段茶樣進(jìn)行感官審評(píng)，利用多元線性回歸分析建立普洱熟茶品質(zhì)和發(fā)酵因子的回歸模型，探明發(fā)酵因子對(duì)普洱熟茶品質(zhì)形成的影響，為有益優(yōu)勢(shì)菌種接種發(fā)酵特色風(fēng)味普洱熟茶工藝提供理論參考和技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種及來(lái)源

少根根霉、黑曲霉、釀酒酵母、綠色木霉，均為云南省自然科學(xué)基金、國(guó)家自然科學(xué)基金普洱茶項(xiàng)目研究組分離、純化、鑒定、保存、篩選、擴(kuò)繁而得，上述菌種均獲授權(quán)專利。

1.2 實(shí)驗(yàn)茶樣

本實(shí)驗(yàn)所采集普洱熟茶發(fā)酵階段樣均為人工添加有益菌進(jìn)行微生物固態(tài)發(fā)酵工藝加工的普洱熟茶生產(chǎn)樣及其對(duì)照樣，其編號(hào)、品名及產(chǎn)地等見(jiàn)表1，每個(gè)樣重復(fù)3次。

1.3 實(shí)驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

時(shí)間：2007年9～12月；地點(diǎn)：云南昆明萬(wàn)紅揚(yáng)茶廠。

1.4 有益菌固態(tài)發(fā)酵

設(shè)五個(gè)處理（少根根霉、黑曲霉、釀酒酵母、綠色木霉、對(duì)照），大體積堆放普洱茶原料各1噸，重復(fù)3次，進(jìn)行普洱熟茶固態(tài)發(fā)酵。

潮水：選用凈化水，潮水量30%，并均勻添加有益菌，堆高1.5m，表面適當(dāng)噴水，至堆表面濕透1.5cm，蓋上濕布，增溫保濕以利發(fā)酵的進(jìn)行。

表1 普洱熟茶加工階段樣的編號(hào)、品名、原料產(chǎn)地及采樣時(shí)間Table 1 The sam ple number,brand and producing area and time ofsamples of Pu-erh tea

翻堆：視發(fā)酵堆溫、濕度及發(fā)酵環(huán)境的變化，進(jìn)行適時(shí)翻堆。

取樣：每次翻堆時(shí)按五點(diǎn)取樣法分別取上層（厚10cm）、中層（厚 30cm）、下層（離地面 5cm）及混合四個(gè)樣各5kg，室內(nèi)自然晾干供感官審評(píng)用。

茶堆溫度、環(huán)境溫度及其濕度等情況每天上午（9：00）、下午（15：00）、晚上（21：30）分別觀察記錄。

1.5 感官審評(píng)方法

感官審評(píng)：干評(píng)茶葉外形的條索、色澤、整碎、凈度，濕評(píng)茶葉內(nèi)質(zhì)的湯色、香氣、滋味、葉底，根據(jù)品質(zhì)特性給予相應(yīng)的評(píng)語(yǔ)，評(píng)分采用百分制。外形30分（條索占10分，整碎占5分，色澤占10分，凈度占5分），內(nèi)質(zhì)70分（香氣占25分，滋味占25分，湯色占10分，葉底占10分），由10位具有良好感官審評(píng)能力的專業(yè)人員進(jìn)行審評(píng)打分，取其平均值為最后得分。審評(píng)時(shí)取茶樣3.0g，150ml沸水沖泡，靜置 5min，重復(fù) 3 次[6～8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中重要物理指標(biāo)變化情況

普洱熟茶固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，茶堆溫度、環(huán)境溫度、環(huán)境濕度等發(fā)酵因子是普洱熟茶固態(tài)發(fā)酵得以順利進(jìn)行和普洱熟茶良好品質(zhì)形成的關(guān)鍵因素。

表2 不同有益菌固態(tài)發(fā)酵普洱熟茶過(guò)程中發(fā)酵因子變化情況Table 2 The variation of fermentational factors during solid-state fermentation by differentbeneficial fungi

如表2所示：

①在五種處理中，接種（綠色木霉、少根根霉、黑曲霉、釀酒酵母）茶堆溫度在30℃～50℃，環(huán)境溫度在7℃～11℃，環(huán)境濕度在50%～80%，對(duì)照樣（不人工接種任何菌），茶堆溫度在25℃～60℃，環(huán)境溫度在7℃～11℃，環(huán)境濕度在58%～80%。

②整個(gè)有益菌固態(tài)發(fā)酵的過(guò)程中，茶堆溫度都在60℃以下。

③第一翻至第三翻，茶堆溫度均能達(dá)到最高溫度，因接入的有益菌種類不同，其達(dá)到最高溫的翻數(shù)也不同。接種黑曲霉的茶堆二翻時(shí)達(dá)到最高溫55℃；接種釀酒酵母菌的茶堆一翻時(shí)達(dá)到最高溫58℃；接種綠色木霉的茶堆，第三翻時(shí)茶堆溫度達(dá)到50℃，因其特殊性，出堆時(shí)溫度達(dá)到最高點(diǎn)53℃，對(duì)照樣（不人工接種任何菌），二翻時(shí)茶堆溫度達(dá)到最高溫60℃。

④每次翻堆后的一至三天內(nèi)，茶堆的溫度均迅速升高，在達(dá)到最高溫后，逐漸下降，隨著翻堆的進(jìn)行，茶堆升溫的程度逐漸減弱，并且呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

⑤接種不同有益菌（綠色木霉、少根根霉、黑曲霉、釀酒酵母）固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，環(huán)境溫度、環(huán)境濕度的變化趨勢(shì)大體一致，環(huán)境溫度主要在7℃～11℃之間，環(huán)境濕度呈現(xiàn)下降→升高→下降的規(guī)律，一般在50%～80%之間變化，因接種的有益菌之間的適生差異，環(huán)境濕度變化有所差異。

⑥茶堆溫度、環(huán)境溫度和環(huán)境濕度三者之間相互協(xié)調(diào)，相互制約。茶堆溫度升高，環(huán)境溫度也相應(yīng)有所上升，環(huán)境濕度則呈下降趨勢(shì)。

⑦因所接種有益菌的最適生長(zhǎng)條件的差異，茶堆溫度、環(huán)境溫度和環(huán)境濕度的變化規(guī)律也存在一定差異性。

2.2 感官審評(píng)結(jié)果

從表3可以看出：用有益菌（綠色木霉、黑曲霉、釀酒酵母菌、少根根霉）固態(tài)發(fā)酵的普洱熟茶出堆樣外形差異不明顯，內(nèi)質(zhì)上有一定的差異，主要表現(xiàn)在滋味和香氣方面。用綠色木霉發(fā)酵的普洱熟茶滋味醇厚回甘，香氣陳香透花木香；黑曲霉發(fā)酵的普洱熟茶滋味醇厚，陳香透花果香；少根根霉發(fā)酵的普洱熟茶滋味醇厚甘滑，陳香濃；釀酒酵母菌發(fā)酵的普洱熟茶滋味醇和甘滑，香氣陳香較顯；對(duì)照普洱熟茶滋味醇厚微苦，香氣陳香。

表3 感官審評(píng)結(jié)果Table 3 The sensory taste result in solid-state fermentation tea

綠色木霉發(fā)酵加工的普洱熟茶感官品質(zhì)得分為94分，黑曲霉發(fā)酵加工的普洱熟茶感官品質(zhì)得分為93分，少根根霉發(fā)酵加工的普洱熟茶感官品質(zhì)得分為90分，釀酒酵母發(fā)酵加工的普洱熟茶感官品質(zhì)得分為88分，對(duì)照的普洱熟茶感官品質(zhì)得分為79分。

2.3 發(fā)酵因子與品質(zhì)量化關(guān)系多元線性回歸分析

通過(guò)對(duì)人工接種有益菌（綠色木霉、黑曲霉、釀酒酵母菌、少根根霉）進(jìn)行普洱熟茶固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵因子的觀察、記錄和分析，結(jié)合對(duì)不同發(fā)酵茶樣的感官審評(píng)評(píng)分結(jié)果，探明在人工接種不同有益菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)普洱熟茶過(guò)程中，發(fā)酵因子的變化規(guī)律及其與發(fā)酵普洱熟茶品質(zhì)的關(guān)系，并建立普洱熟茶加工過(guò)程中發(fā)酵因子與品質(zhì)關(guān)系的回歸模型。

品質(zhì)得分(Y)、發(fā)酵天數(shù)（X1）、茶堆溫度（X2）、環(huán)境溫度（X3）、環(huán)境濕度（X4）的觀察記錄值進(jìn)行多元線性回歸分析，可以得到回歸方程：

①綠色木霉固態(tài)發(fā)酵的回歸方程：

Y=91.243+0.107X1+0.073X2+0.337X3-0.131X4（復(fù)相關(guān)系數(shù) R2＝0.9685）

回歸系數(shù)為+0.107、+0.073、+0.337、-0.131

回歸方程常數(shù)項(xiàng)β＝91.2426

②黑曲霉固態(tài)發(fā)酵的回歸方程：

Y=90.442+0.066X1-0.011X2-0.069X3+0.006X4（復(fù)相關(guān)系數(shù) R2＝0.9607）

回歸系數(shù)為+0.066、-0.011、-0.069、+0.006

回歸方程常數(shù)項(xiàng)β＝90.4422

③少根根霉固態(tài)發(fā)酵的回歸方程：

Y=87.144+0.055X1+0.012X2+0.16X3+0.014X4（復(fù)相關(guān)系數(shù) R2＝0.9944）

回歸系數(shù)為+0.055、+0.012、+0.160、+0.014

回歸方程常數(shù)項(xiàng)β＝87.1444

④釀酒酵母菌固態(tài)發(fā)酵的回歸方程：

Y=83.898+0.164X1+0.008X2+0.223X3-0.082X4（復(fù)相關(guān)系數(shù) R2＝0.9969）

回歸系數(shù)為+0.164、+0.008、+0.223、-0.082

回歸方程常數(shù)項(xiàng)β＝83.8978

3 討論與結(jié)論

普洱熟茶固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，微生物種類、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、環(huán)境溫度和濕度等因素對(duì)普洱熟茶品質(zhì)的形成均具有重要的影響作用。這些發(fā)酵條件不僅影響微生物的生命活動(dòng)，而且影響制茶過(guò)程中化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化，從而影響所發(fā)酵出的普洱熟茶的感官品質(zhì)。普洱熟茶進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵大生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)酵條件的差異導(dǎo)致了普洱熟茶品質(zhì)的差異。

3.1 發(fā)酵過(guò)程中茶堆溫度變化情況探討

溫度是標(biāo)志物體冷熱程度的參數(shù)，反映了物體分子運(yùn)動(dòng)的劇烈程度。

茶堆溫度是普洱熟茶固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的主要控制因子，茶堆溫度的高低，直接反映了茶堆中茶內(nèi)含物質(zhì)和水分子的運(yùn)動(dòng)速度，發(fā)酵茶堆內(nèi)部的最低溫度不能低于28℃，最高溫度不能高于65℃，當(dāng)前普洱熟茶大生產(chǎn)中的堆溫主要通過(guò)翻堆來(lái)進(jìn)行調(diào)控。

人工接種一定比例的有益菌（綠色木霉、少根根霉、黑曲霉、釀酒酵母）進(jìn)行普洱熟茶固態(tài)發(fā)酵后，堆溫上升較快，這是由于有益菌附著在具有一定濕度的茶坯基質(zhì)上，茶坯基質(zhì)為有益菌提供其生長(zhǎng)代謝所需的碳源、氮源、礦物質(zhì)元素、水及其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使得有益菌快速大量地繁殖，隨著有益菌數(shù)量的增加，呼吸代謝中釋放的熱量也相應(yīng)增加，使茶堆溫度迅速升高，隨著發(fā)酵的持續(xù)進(jìn)行，茶堆升溫的程度逐漸減弱，達(dá)到最高溫后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)有益菌的適宜生長(zhǎng)溫度為28℃～37℃，最高耐受溫度為45℃～50℃，一般不超過(guò)60℃，隨著固態(tài)發(fā)酵的進(jìn)行，有益菌代謝產(chǎn)物的積累，代謝呼吸中放熱較多，使得茶堆溫度升高，酸度增加，逐漸偏離了有益菌的最佳生長(zhǎng)條件，有益菌生命活動(dòng)減弱，茶堆溫度下降。

人工接種有益菌種進(jìn)行普洱熟茶固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵葉的溫度一般保持在符合微生物生長(zhǎng)的范圍內(nèi)，適宜的溫度既能促使發(fā)酵葉中產(chǎn)生多種物質(zhì)的化學(xué)變化，還能抑制有害雜菌的生長(zhǎng)，更為重要的是促使有益微生物大量滋生，使得微生物分泌的胞外酶的量及其高效的催化活性相應(yīng)增加，促進(jìn)發(fā)酵葉的系列變化[9，10]。當(dāng)堆溫保持在一定的范圍時(shí)，加工出的普洱熟茶具有較好的品質(zhì)特征，當(dāng)堆溫低于或高于一定的范圍時(shí)，加工出的普洱熟茶的品質(zhì)不是很理想，堆溫過(guò)低，一些化學(xué)成分氧化降解所需的能量無(wú)法滿足，導(dǎo)致發(fā)酵不足；堆溫過(guò)高，又會(huì)導(dǎo)致碳化燒心，同樣不利于普洱熟茶良好風(fēng)味品質(zhì)的形成。

因此，在人工接種優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行普洱熟茶固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，有效地控制好發(fā)酵溫度有利于普洱熟茶良好品質(zhì)的形成。

3.2 發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵因子之間關(guān)系的探討

環(huán)境溫度是表示環(huán)境冷熱程度的物理量，是決定普洱熟茶發(fā)酵室內(nèi)溫度高低的重要指標(biāo)之一，不同環(huán)境溫濕度條件對(duì)人工接種有益菌進(jìn)行普洱熟茶發(fā)酵的影響程度不同。

高溫高濕情況下，有利于減少茶堆中水分的散失，有利于茶堆持續(xù)高溫，提高酶的活性，加速發(fā)酵葉內(nèi)含物質(zhì)的轉(zhuǎn)化速率，抑制有害雜菌的生長(zhǎng)、散發(fā)雜異味，縮短發(fā)酵時(shí)間，提高普洱熟茶的品質(zhì)。

高溫低濕情況下，茶堆水分會(huì)不斷散失，茶堆高溫持續(xù)時(shí)間短，發(fā)酵葉內(nèi)含物質(zhì)的轉(zhuǎn)化速率慢，發(fā)酵不均勻，不利于普洱熟茶品質(zhì)的形成。

低溫高濕情況下，茶堆中雖然水分散失較慢，但堆溫升溫慢，發(fā)酵葉內(nèi)含物質(zhì)轉(zhuǎn)化速率慢，導(dǎo)致腐生菌滋生，對(duì)普洱熟茶良好品質(zhì)的形成不利。

低溫低濕情況下，茶堆水分散失慢，導(dǎo)致茶堆溫度內(nèi)部高而外層低，不利于發(fā)酵葉內(nèi)含物質(zhì)成分的均勻轉(zhuǎn)化，發(fā)酵均勻度差，可控性差，不利于普洱熟茶品質(zhì)的形成。

綜上所述，本文針對(duì)人工接種有益菌進(jìn)行普洱熟茶固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的茶堆溫度、環(huán)境因子進(jìn)行了分析研究，揭示了各因子間的相互協(xié)調(diào)、相互影響的關(guān)系。茶堆溫度要控制在40℃～60℃，在冬季，環(huán)境溫度控制在7℃～10℃，環(huán)境濕度控制在70%～80%，發(fā)酵時(shí)間控制在50～60d，有利于普洱熟茶品質(zhì)風(fēng)味的形成。通過(guò)對(duì)不同有益菌發(fā)酵生產(chǎn)的普洱熟茶感官品質(zhì)及發(fā)酵因子研究而建立起不同優(yōu)勢(shì)有益微生物固態(tài)發(fā)酵普洱熟茶回歸方程，在人工接種有益菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)普洱熟茶的過(guò)程中，利用回歸方程可以實(shí)現(xiàn)定向控制溫度、濕度、翻堆周期等技術(shù)，改善普洱熟茶固態(tài)發(fā)酵因子，以縮短生產(chǎn)周期，促進(jìn)內(nèi)含物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，使普洱熟茶固態(tài)發(fā)酵朝著有益于特定品質(zhì)形成的方向發(fā)展，生產(chǎn)不同風(fēng)味普洱熟茶。

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