孫立娟 李曉洲 史云芳 李 巖 岳天孚 張 穎

天津醫(yī)科大學總醫(yī)院遺傳室(300052)

短串聯(lián)重復序列(STR)基因座因在人類基因組中具有分布廣泛、多態(tài)信息含量較高等特點受到國內外學者的關注,目前被廣泛應用于產前診斷、群體遺傳學以及法醫(yī)學等領域。STR基因座的群體遺傳學數據具有地域及種族差異[1],而目前大多 STR基因座的相關數據來自高加索人,因此,有必要篩選出本地區(qū)雜合度較高的 STR基因座。據報道,21號染色體上唐氏綜合征(DS)關鍵區(qū)域內或附近的D21S1411和 D21S1413 2個 STR基因座的期望雜合度較高。故本研究選取這 2個基因座,調查其在天津市漢族胎兒中的雜合度(Ho)。同時,計算這 2個STR基因座的多態(tài)信息含量(PIC)、個體識別率(DP)和非父排除率(PE)等群體遺傳學數據,為基因診斷及產前基因診斷 DS提供實驗依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

211例產前診斷樣本,包括絨毛組織 49例,羊水細胞 162例,均采自至天津醫(yī)科大學總醫(yī)院產前診斷中心就診的妊娠 7～24周婦女,所有樣本經細胞遺傳學方法證實為正常核型。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用常規(guī)苯酚 -氯仿法提取絨毛組織和羊水細胞的基因組 DNA。1.2.2引物的選擇與合成 D21S1411和 D21S1413 STR基因座的引物序列參照基因庫(www.GDB.org),由上海生工合成。

1.2.3 聚合酶鏈反應(PCR) PCR反應體積為 25μl,反應體系為：1×PCR緩沖液,2mmol/L MgCl2、0.2mmol/L dNTP、1 U Taq酶、約 120ng DNA,D21S1411和 D21S1413基因座引物終濃度分別為 0.1μmol/L和 0.3μmol/L。反應條件為：94℃預變性 3min;94℃變性 15s,62℃退火延伸 1m in,共 35個循環(huán);62℃延伸 45min,4℃保存。

1.2.4 PCR擴增產物的檢測 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),300 V恒壓 1.5h,硝酸銀染色。采用核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分析產物,記錄結果。

1.2.5 建立等位基因分型標準階梯 挑選樣本中D21S1411和 D21S1413 2個 STR基因座所有的純合子,重新行 PAGE,經核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分別測定這 2個 STR基因座各等位基因的分子量,建立 STR基因座各自的等位基因分型標準階梯。

1.3 統(tǒng)計學處理

對觀察到的 D21S1411和 D21S1413基因座的基因型分布進行 χ2檢驗,驗證是否符合 Hardy-Weinberg平衡定律。采用Powerstate V12軟件對群體遺傳學指標進行分析,獲得相關數據。

2 結果

2.1 復合 PCR擴增產物 PAGE電泳檢測結果

211例產前診斷樣本均擴增成功,經 PAGE電泳檢測均表現為 1條帶或 2條帶,經核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分析發(fā)現,所有雜合子樣本 2條帶對應峰的峰高之比均約為 1：1。見圖 1～3。

圖 3 樣本 5分子量曲線圖 D21S1413 STR基因座出現 1個峰,表現為純合子,片段大小為 160 bp;D21S1411 STR基因座出現 2個峰,表現為雜合子,片段大小分別為 303 bp和 287 bp

2.2 D21S1411和 D21S1413基因座等位基因分型階梯

經核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分析,天津市 211例漢族胎兒中D21S1411基因座共發(fā)現9種等位基因,等位基因片段長度介于 287～319 bp之間,相鄰等位基因間相差 4bp,按片段由小到大依次命名為 1～9。天津市 211例漢族胎兒中 D21S1413基因座共發(fā)現 7種等位基因,等位基因片段長度介于 160～188 bp之間,相鄰等位基因間相差 4bp,按片段由小到大依次命名為 1～7。見圖 4、圖 5。

2.3 D21S1411和 D21S1413基因座的等位基因及基因型分布

在 211例漢族胎兒樣本中,D21S1411基因座共發(fā)現 45種基因型;D21S1413基因座共發(fā)現 28種基因型。天津市漢族胎兒 D21S1411和 D21S1413基因座的基因型例數及等位基因頻率見表 1和 2。經檢驗,2個 STR基因座的基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡定律。

表 1 D21S1411各基因型分布及等位基因頻率

表 2 D21S1413各基因型分布及等位基因頻率

2.4 D21S1411和 D21S1413基因座的群體遺傳學特征

天津市漢族胎兒 D21S1411和 D21S1413基因座的 Ho、PIC、DP、PE等群體遺傳學指標分析結果見表3。

表3 D21S1411和D 21S1413基因座的群體遺傳學特征

3 討論

STR基因座在人類基因組中分布廣泛,平均每隔6～10kb就有一個。STR基因座多由 2～6個堿基作為核心單位,核心單位重復次數多為 15～30次,核心單位重復次數的變化構成了 STR基因座的遺傳多態(tài)性,這種重復次數的差異在基因傳遞過程中遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律[2]。STR基因座片段長度較短,一般為 100～400bp,很容易通過 PCR擴增,電泳分型。STR分型具有很高的靈敏度和良好的重復性,分型結果穩(wěn)定可靠。由于檢測方法簡便、快速、準確度高,STR基因座目前已發(fā)展為最主要的個體識別檢測標記,并廣泛應用于群體遺傳學、產前診斷、人口統(tǒng)計學等多個領域。

DS是最常見的染色體三體綜合征,在新生兒中的發(fā)病率為 1/600～1/800,主要表現為智力低下及特殊面容。產前診斷發(fā)現 DS并及時終止妊娠是降低此類患兒出生的有效手段。目前產前診斷的常用方法是細胞遺傳學方法,即通過絨毛取樣、羊膜腔穿刺或臍靜脈穿刺獲得胎兒細胞,然后進行染色體核型分析。該方法已成為產前診斷染色體異常的金標準。但該方法存在步驟繁瑣,均需人工操作等不足,不適合大規(guī)模應用。1993年 Mansfield等[3]首次將 STR基因座引入產前診斷染色體數目異常的研究,通過熒光標記引物擴增 21、18號染色體上的 STR基因座,在 13例 DS和18三體綜合征中成功診斷 9例。同一STR基因座在不同個體可能出現不同長度的等位基因,其可能性的概率與該 STR基因座的雜合度和多態(tài)信息含量密切相關[4]。正常個體 STR基因座擴增后可表現為 2種情況：一種為純合子,表現為 1條帶;一種為雜合子,表現為 2條帶,定量之比約為 1：1。而三體樣本經 STR基因座擴增后,可表現為以下 3種情況：① 3個等位基因各不相同,即雜合子時,表現為 3條帶,定量之比約為 1：1：1;②3個等位基因中有 2個相同,即半雜合子時,表現為 2條帶,定量之比約為 2：1;③3個等位基因均相同,即純合子時,出現 1條帶。本實驗中,所有胎兒均為正常核型,電泳均出現 1條帶或 2條帶,核酸/蛋白凝膠圖像管理分析系統(tǒng)分析擴增產物,發(fā)現所有雜合子 2條帶對應峰的峰高之比均約為 1：1。

為避免因 STR基因座雜合度不高所造成的漏診,應盡可能挑選雜合度較高的 STR基因座作為遺傳標記,同時可以聯(lián)合 2個甚至更多的基因座以提高診斷的準確率。由于 STR基因座核心序列的重復次數在不同地區(qū)及不同種族中會有所不同,甚至差異顯著[1],因而在應用 STR-PCR進行 DS產前基因診斷之前必須篩選出本地區(qū)本民族雜合度高的 STR基因座作為 21號染色體的遺傳標記。本實驗對天津市211例漢族胎兒樣本 D21S1411和 D21S1413基因座進行分析。D21S1411基因座發(fā)現 9種等位基因,45種基因型;D21S1413基因座發(fā)現 7種等位基因,28種基因型。2個基因座基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡定律,說明該樣本可反應天津市漢族胎兒的遺傳狀況。據文獻[5]報道,DP＞0.8,PE＞0.5為多態(tài)信息含量高的標準,D21S1411和 D21S1413基因座的DP分別為 0.967和 0.947,PE分別為 0.516和 0.739,2個基因座均符合上述標準,可見這 2個基因座在天津漢族胎兒中多態(tài)信息含量較高,可用于染色體數目異常的研究。

本實驗選用非變性 PAGE和銀染法對 PCR產物進行檢測。PAGE是一種常用的 DNA檢測方法,凝膠化學性質穩(wěn)定,樣品用量少,其靈敏度較高。PAGE集濃縮效應、分子篩效應和電荷效應為一體,所以電泳分辨率較高,尤其適用于對較小的 DNA片段的分析(5～500bp)。而采用銀染法染色,可以提高聚丙烯酰胺凝膠 DNA染色的靈敏度。該方法成本低,使用的儀器設備簡單,結果可以直接用肉眼觀察,易于掌握,尤其適用于廣大基層醫(yī)院。但應用 PAGE電泳和銀染法檢測 STR基因座擴增產物時,常在目標片段條帶附近發(fā)現一些染色較淺的影子帶。這些非特異性條帶在一定程度上影響了分析帶型的準確性,甚至可能對等位基因的判讀產生影響。如何消除這些影子帶是學者們一直致力研究的問題,但迄今為止尚無統(tǒng)一的認識和令人滿意的方法。關于影子帶產生的機理,Murray等[6]在研究 CA二核苷酸重復序列的PCR擴增時認為,CA重復序列區(qū)中 2bp的隨機缺失或增加所導致的影子帶可能是 DNA鏈在復制過程中滑動所致,并曾設想一種高效的 DNA聚合酶可以減少影子帶的產生。武輝等[7]在三核苷酸重復序列的PCR擴增中,用普通 Taq DNA聚合酶與具有 3′→5′外切活性的 pwo DNA聚合酶相混合,可以消除影子帶,在一定程度上證實了 Murray等的觀點。在本實驗中體會到,對于非變性 PAGE而言,恒定的電壓和電泳溫度是關鍵,因為溫度可直接影響 DNA分子內部穩(wěn)定力的形成及其所決定的分子構像,從而影響條帶的檢出。室溫電泳適用于大多數情況,但由于電泳時,尤其是高電壓下電泳時,凝膠溫度會升高,有可能對 STR基因座擴增產物的正確檢出造成不良影響。針對上述情況,通?？刹扇p少凝膠厚度、降低電壓、空氣冷卻或循環(huán)水冷卻等措施來避免影子帶的產生。本實驗采用了控制電泳溫度,并選用 150V低電壓等措施來減少影子帶的出現。

隨著 DS產前篩查的普及,因篩查結果為高風險而行產前診斷的妊娠婦女日益增多,傳統(tǒng)的細胞遺傳學方法已不能滿足臨床產前診斷的需要。STRPCR技術用于產前診斷染色體數目異常,能夠與細胞遺傳學方法互補,對于臨床而言是一種較好的選擇。

1 Andonova S,Vazharova R,Dim itrova V,et al.Introduction of the QF-PCR analysis for the purposesof prenatal diagnosis in Bulgaria-estimation of applicability of 6 STR markers on chromosomes 21 and 18[J].Prenat Diagn,2004,24(3)：202-208.

2 Edwards A,Civitello A,Hammond HA,et al.DNA typingand genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats[J].Am J Hum Genet,1991,49(4)：746.

3 Mansfield ES.Diagnosis of Down syndrome and other aneuploidies using quantitative polymerase chain reaction and small tandem repeat polymorphisms[J].Hum Mol Genet,1993,2(1)：43-50.

4 Cirigliano V,VoglinoG,Ordo?ez E,etal.Rapid prenatal diagnosisof common chromosome aneuploidies by QF-PCR,results of 9 years of clinical experience[J].Prenat Diagn,2009,29(1)：40-49.

5 童大躍,孫宏鈺,伍新堯,等.中國南方漢族人群 9個 STR基因座多態(tài)性分析[J].中山大學學報,2009,30(4)：400-403.

6 Murray V,Chutima M,England PR.The determ ination of the sequences present in the shadow bands of a dinucleiotide repeat PCR[J].Nuc leic Acids Res,1993,21(10)：2395-2398.

7 武輝,張思仲,肖翠英.三核苷酸重復序列PCR擴增中影子帶動產生及其消除的方法[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志,1998,15(1)：42-45.