杜小英，李秋菲，姜錦花，宋愿智

(1.陜西方舟制藥有限公司，陜西 西安 710075; 2.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 西安 710061)

小兒香橘丸由木香、陳皮、蒼術(shù)、白術(shù)、茯苓等19味藥材制方，具有健脾和胃、消食止瀉功能，用于小兒飲食不節(jié)引起的嘔吐便瀉、脾胃不和、身燒腹脹、面黃肌瘦、不思飲食等癥的治療[1]。小兒香橘片為其改劑型品種，原丸劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有一項(xiàng)顯微鑒別，無(wú)含量測(cè)定要求。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，根據(jù)《藥品注冊(cè)管理辦法》及相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則[2～3]，筆者對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，淘汰了比較繁雜且缺乏特異性的原鑒別項(xiàng)，增加了白術(shù)、蒼術(shù)、木香、砂仁、陳皮、枳實(shí)、香附及山楂藥材中有效成分熊果酸的薄層色譜(TLC)法鑒別，并用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定制劑中陳皮和枳實(shí)中橙皮苷含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters 600E型高效液相色譜儀，Waters 600泵，Waters 2487紫外檢測(cè)器;Millog色譜工作站，奧豪斯電子天平等。橙皮苷(批號(hào)為110721－200613，供含量測(cè)定用)、熊果酸(批號(hào)為 110742－200516)對(duì)照品及白術(shù)(批號(hào)為120925－200708)、蒼術(shù)(批號(hào)為120932－200405)、木香(批號(hào)為 120921－200607)、砂仁(批號(hào)為120985－200505)、陳皮(批號(hào)為 120969－200507)、枳實(shí)(批號(hào)為120936－200503)、香附(批號(hào)為121059－200706)對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;小兒香橘片(批號(hào)分別為20080915，20080916，20080917)及不含被測(cè)藥材的陰性樣品(陜西方舟制藥有限公司);硅膠G(青島海洋化工廠(chǎng))，甲醇(色譜純)，水(超純水)，其他試劑(分析純)。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

白術(shù):取本品適量，研細(xì)，稱(chēng)取5 g，加乙醚30 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液蒸至1 mL，作為供試品溶液;另取白術(shù)對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液;取不含白術(shù)的陰性樣品，照供試品溶液制法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法[2005年版《中國(guó)藥典(一部)附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯(19∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液不顯色、無(wú)干擾(圖1 A)。

蒼術(shù):取本品適量，研細(xì)，稱(chēng)取2 g，加正己烷20 mL，超聲處理15 min濾過(guò)，濾液室溫下?lián)]至約1 mL，作為供試品溶液;另取蒼術(shù)對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液;取不含蒼術(shù)的陰性樣品，照供試品溶液制法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法[2005年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)－乙酸乙酯(20∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%對(duì)二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液不顯色，無(wú)干擾(圖1 B)。

木香:取本品適量，研細(xì)，稱(chēng)取2 g，加三氯甲烷20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液室溫下?lián)]至約1 mL，作為供試品溶液;另取木香對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液;取不含木香的陰性樣品，照供試品溶液制法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法[2005年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，分別吸取上述3種溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－環(huán)己烷(5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸試液，加熱顯色至斑點(diǎn)清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液不顯色、無(wú)干擾(圖1 C)。

砂仁:取白術(shù)項(xiàng)下的供試品溶液作為供試品溶液;另取砂仁對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液;取不含砂仁的陰性樣品，照供試品溶液制法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法[2005年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，正己烷－醋酸乙酯(8.5∶1.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸試液。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液不顯色、無(wú)干擾(圖1 D)。

熊果酸:取本品適量，研細(xì)，稱(chēng)取2 g，加醋酸乙酯15 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液濃縮至約1 mL，作為供試品溶液;另取熊果酸對(duì)照品適量，加甲醇制成1 g/L的溶液，作為對(duì)照品溶液;取不含山楂的陰性樣品，照供試品溶液制法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法[2005年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－醋酸乙酯－三氯甲烷－ 冰醋酸(10 ∶3 ∶0.5 ∶3.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以硫酸乙醇試液(3→10)試液。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液不顯色、無(wú)干擾(圖 1 E)。

陳皮:取本品適量，研細(xì)，稱(chēng)取2 g，加醋酸乙酯10 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液;另取陳皮對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液;取不含陳皮的陰性樣品，照供試品溶液制法制備陰性對(duì)照溶液。照TLC法[2005年版《中國(guó)藥典(一部)附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一以0.5%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯－甲醇－水(10∶1.7∶1.3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)約3 cm，再以甲苯－醋酸乙酯－甲酸－水(20∶10∶10∶1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)約8 cm，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的主熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液不顯色，無(wú)干擾(圖1 F)。

枳實(shí):取本品適量，研細(xì)，稱(chēng)取3g，加甲醇15mL，超聲處理20min，濾過(guò)，濾液濃縮至約5 mL，作為供試品溶液;另取枳實(shí)對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液;取不含枳實(shí)的陰性樣品，照供試品溶液制法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法[2005年版《中國(guó)藥典(一部)附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯－三氯甲烷－丙酮(8∶2∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的主熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液不顯色、無(wú)干擾(圖1 G)。

香附:取本品適量，研細(xì)，稱(chēng)取5 g，加乙醚10 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)哟姿嵋阴? mL溶解，作為供試品溶液;另取香附對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液;取不含香附的陰性樣品，照供試品溶液制法制備陰性對(duì)照品溶液。照TLC法[2005年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄Ⅵ B]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯－醋酸乙酯－冰醋酸(9.5 ∶0.5 ∶0.5)為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液不顯色、無(wú)干擾(圖 1 H)。

圖1 薄層色譜圖

2.2 橙皮苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Kromosil ODS C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:0.1%磷酸－乙腈(78 ∶22);柱溫:室溫;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):284 nm。理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000，在此條件下的高效液相色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 橙皮苷的高效液相色譜圖

2.2.2 溶液制備

取本品20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取約1 g，精密稱(chēng)定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取40 min，放冷，稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密稱(chēng)取橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成0.1 g/L的溶液，即得對(duì)照品溶液。取不含橙皮苷的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線(xiàn)性關(guān)系考察:分別精密吸取對(duì)照品溶液 3，5，10，15，20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以進(jìn)樣量 X(μg)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程 A=1 976 177 C+23 809，r=0.9995(n=5)。結(jié)果表明，橙皮苷進(jìn)樣量在0.3～2.0 μg范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)測(cè)定。結(jié)果峰面積的 RSD為1.03%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0，1，2，3，5，8 h時(shí)測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為1.50%(n=6)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):精密稱(chēng)取同一批樣品，依法制備供試品溶液并測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為0.83%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):取已知濃度的供試品溶液6份，分別精密加入一定量橙皮苷對(duì)照品，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 橙皮苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品，依法測(cè)定。結(jié)果10批樣品橙皮苷含量均值為2.45 mg/片。

3 討論

小兒香橘片處方組成龐大、繁雜，目前有些藥材的有效部位還不十分明確，在試驗(yàn)過(guò)程中各成分互相干擾影響，但原丸劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)幾種藥材進(jìn)行顯微鑒別，對(duì)主成分無(wú)含量測(cè)定要求，這顯然不能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。改劑型后，增加了8味藥材的TLC鑒別和1項(xiàng)含量測(cè)定，可有效保證該產(chǎn)品的質(zhì)量。

[1]WS3－B－0026－89，衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第1冊(cè))[S].

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄 7，附錄 31.

[3]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則(2005)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2005:196.