彭繼升，楊晉翔，高彥彬

胰島素抵抗(IR)在2型糖尿病(T2DM)和非酒精性脂肪肝(NAFLD)的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)著重要地位，可以說是IR將二者聯(lián)系起來。血糖和血脂的代謝紊亂是糖尿病的重要特征，而NAFLD正是由于脂質(zhì)代謝紊亂而引起的肝臟脂肪變性，血糖的異常也必然影響到脂代謝的紊亂。本實(shí)驗(yàn)觀察了降濁化瘀合劑對(duì)T2DM合并NAFLD大鼠糖脂代謝和胰島素敏感指數(shù)(HOMA-IR)的影響。

1 材料與試劑

1.1 動(dòng)物及飼料

清潔級(jí)雄性 SD大鼠40只，體重150g～190g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供;動(dòng)物飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，改進(jìn)高脂飼料構(gòu)成比為2%膽固醇，0.5%膽酸鈉，0.2%丙硫氧嘧啶，5%蔗糖，10%豬油，82.3%基礎(chǔ)飼料;普通高脂飼料構(gòu)成比為2%膽固醇，10%豬油，88%基礎(chǔ)飼料。

1.2 主要試劑

鏈脲佐菌素(STZ)由美國 Sigma公司提供，臨用時(shí)以0.1mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液 pH 4.4配成1%STZ溶液;馬來酸羅格列酮(文迪雅)由葛蘭素史克(天津)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格 4mg/片;降濁化瘀合劑(由柴胡、枳實(shí)、茵陳、澤瀉、熟軍、全栝樓、丹參等按一定比例組成)，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑中心提供，用煎煮法浸提濃縮至稠膏狀，以蒸餾水稀釋成2g生藥/ml的濃度;游離脂肪酸(FFA)酶聯(lián)免疫試劑盒由美國GBD公司提供;胰島素放免檢測試劑盒由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所提供。

2 方法

2.1 造模方法及分組處理

將40只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)基礎(chǔ)飼料7d后，按體重隨機(jī)分為2組，正常組8只，高脂組32只。正常組喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料，高脂組喂養(yǎng)改進(jìn)高脂飼料，高脂組大鼠喂養(yǎng)4周后隨機(jī)處死2只，取肝臟組織進(jìn)行HE染色，觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)改變(見圖1、圖2)。3d后各組大鼠禁食12h，高脂組給予一次性腹腔注射 STZ 30mg/kg，正常組給予同等體積的枸櫞酸緩沖液腹腔注射。注射48h后，各組大鼠禁食12h后斷尾取血，測空腹血糖(FPG)、空腹胰島素水平(FINS)。以空腹血糖高于7.8mmol/L作為T2DM診斷的血糖標(biāo)準(zhǔn)，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(HOMA-IR)，以判定胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)誘導(dǎo)成功。高脂組大鼠肝臟形態(tài)學(xué)符合NAFLD病理改變(見圖1、圖2)，血糖全部符合 T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)，且 FINS、HONA-IR均明顯高于正常組(見表1)，全部符合造模要求，至此T2DM合并NAFLD大鼠造模過程結(jié)束。

將造模成功大鼠按1∶1∶1比例隨機(jī)分為模型組、中藥組和西藥組。中藥組給予降濁化瘀合劑10ml/kg/d(生藥20g/kg/d)灌胃，西藥組給予文迪雅2mg/kg/d灌胃，模型組和正常組灌服蒸餾水10ml/kg/d。正常組仍給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，模型組、中藥組、西藥組給予高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)給藥觀察8周。末次給藥后空腹過夜，以0.4%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，收集血清用于指標(biāo)的測定，取肝備用，HE染色，進(jìn)行病理學(xué)觀察。

2.2 檢測方法

空腹血糖(FPG)、血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)經(jīng)全自動(dòng)生化儀(日立7600)檢測;空腹胰島素(FINS)用放免法，F(xiàn)FA采用酶聯(lián)免疫法，均嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。胰島素抵抗指數(shù)計(jì)算(HOMA-IR)=FINS×FBG/22.5。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行，計(jì)量資料以珋x±s表示;2組間比較用 t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)。治療前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 T2DM合并NAFLD大鼠模型的建立

3.1.1 肝臟組織HE染色 喂養(yǎng)4周后，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞形態(tài)正常;肝竇正常，連接成網(wǎng)狀(見圖1)。高脂組肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量大小不一的脂肪空泡，符合NAFLD病理改變(見圖2)。

圖1 正常組肝組織(HE染色×200)

圖2 高脂組肝組織(HE染色×200)

3.1.2 胰島素抵抗情況 表1顯示，大鼠高脂飼料喂養(yǎng)加小劑量STZ注射后，第5周所測血糖結(jié)果全部符合 T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn);其 FBG、FINS明顯高于正常組(P＜0.01)，HOMA-IR也明顯高于正常組大鼠(P＜0.01)。

表1 FBG、FINS和HOMA-IR的比較(珋x±s)

3.2 藥物干預(yù)后

3.2.1 對(duì)FPG、FINS和HOMA-IR的影響 表2顯示，與正常組大鼠相比較，模型組大鼠 FPG、FINS明顯升高，HOMA-IR也升高(P＜0.01)。與模型組大鼠比較，西藥組FBG與HOMA-IR降低(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與馬來酸羅格列酮改善IR、降糖的作用相一致;中藥組FPG雖無明顯變化，但HOMAIR低于模型組大鼠(P＜0.05)，提示中藥降濁化瘀合劑具有改善IR的作用。

表2 FPG、FINS和HOMA-IR的比較(珋x±s)

3.2.2 對(duì)血脂的影響 表3顯示，與正常組大鼠相比較，模型組大鼠血清 TG、TC、LDL-C、FFA水平均明顯升高(P＜0.01)。與模型組大鼠相比較，中藥組、西藥組大鼠的血清TG、TC水平均顯著降低(P＜0.01);2組血清LDL-C與模型組比較無差異(P＞0.05);中藥組血清FFA顯著低于模型組(P＜0.05)，西藥組血清FFA與模型組比較無明顯變化(P＞0.05)。中藥組血清 TG、FFA水平顯著低于西藥組(P＜0.01)。

表3 結(jié)果血脂水平的比較(珋x±s)

4 討論

4.1 T2DM合并NAFLD大鼠模型的建立

NAFLD是T2DM的常見并發(fā)癥，常與肥胖、高脂血癥等心腦血管病危險(xiǎn)因素一起出現(xiàn)，且發(fā)病率越來越高。為對(duì)T2DM合并NAFLD的發(fā)病機(jī)制和治療等進(jìn)行深入研究，建立一個(gè)理想的動(dòng)物模型尤為重要。

目前T2DM的動(dòng)物模型多采用遺傳因素占主導(dǎo)作用或STZ誘導(dǎo)的方法，有學(xué)者提出長期高脂飲食加小劑量STZ建立更為符合人類T2DM特點(diǎn)的動(dòng)物模型;NAFLD最常用的動(dòng)物模型是通過高脂和/或高膽固醇飼料喂養(yǎng)制備?？梢钥闯觯咧嬍呈荰2DM、NAFLD動(dòng)物成模的重要因素。鑒于以上認(rèn)識(shí)并參考文獻(xiàn)［1-2］，我們采用改良高脂飼料(在普通高脂飼料中加入少量蔗糖、膽酸鹽和丙基硫氧嘧啶)，結(jié)合小劑量STZ處理，建立T2DM合并NAFLD的大鼠模型。

本法在飼料中加入蔗糖，可增加長鏈脂肪酸的合成而使TG的合成增加，且當(dāng)血糖升高時(shí)，促使由乙酰酶A轉(zhuǎn)變成的膽固醇也增加［3］。飼料中加入少量膽酸鹽和抗甲狀腺藥物丙基硫氧嘧啶，可干擾脂代謝，誘發(fā)高脂血癥，促進(jìn)脂肪肝的形成。然后以STZ劑量30mg/kg一次性腹腔注射，在一定時(shí)間內(nèi)破壞適量的胰島β細(xì)胞，引起糖代謝紊亂。本建模方法以肝臟形態(tài)學(xué)改變、血糖、胰島素敏感指數(shù)作為大鼠建模成功的觀測指標(biāo)，成功建立模型時(shí)間僅用5周。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，本造模方法成模率高、死亡率低、造模周期短，且模型符合人類 T2DM合并NAFLD的發(fā)病特點(diǎn)，是研究T2DM并NAFLD比較理想的動(dòng)物模型。

4.2 降濁化瘀合劑對(duì)T2DM合并NAFLD大鼠的影響

T2DM患者常易并發(fā)NAFLD。流行病學(xué)資料顯示，21%～78%的2型糖尿病患者中存在脂肪肝。目前對(duì)于二者的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但一致認(rèn)為IR是二者共同的發(fā)病基礎(chǔ)，且糖脂代謝紊亂在發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。在T2DM患者中，高血糖合并脂質(zhì)代謝紊亂頗為常見，其典型的脂譜表現(xiàn)為血清TC、TG、FFA及 LDL-C增高，其機(jī)制主要為 IR和高血糖對(duì)脂代謝的影響，促進(jìn)TC的沉積和高TC血癥的形成［4］。肝臟是脂類物質(zhì)消化、吸收、代謝等過程中的重要器官，當(dāng)肝臟中脂質(zhì)的生成超過肝臟的轉(zhuǎn)運(yùn)能力時(shí)，便造成肝臟中脂質(zhì)的累積和脂肪肝的形成。

隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂對(duì)細(xì)胞存在著毒性作用，即所謂“脂毒性”，其與T2DM及并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［5］。本次實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料誘導(dǎo)IR和NAFLD的產(chǎn)生，即可看作是“脂毒性”的作用。注射STZ使T2DM模型建立后，IR及INS分泌不足的狀況又進(jìn)一步加重了脂代謝紊亂的程度。而血液中過高濃度的FFA所產(chǎn)生的“脂毒性”，又可使β細(xì)胞功能進(jìn)一步下降，IR進(jìn)一步加劇，加重了T2DM，如此形成惡性循環(huán)。因此，T2DM合并NAFLD的治療打破這種惡性循環(huán)尤為重要。

降濁化瘀合劑是導(dǎo)師楊晉翔和高彥彬教授治療T2DM合并NAFLD的有效方劑。我們認(rèn)為，T2DM合并NAFLD的發(fā)生，多由先天不足、飲食不節(jié)、嗜食肥甘厚味，加之嗜臥少動(dòng)，日久導(dǎo)致脾失運(yùn)化、精微不化、釀濕生痰、郁于肝中而成，日久可由實(shí)致虛、臟腑失調(diào)、變證百出，故倡導(dǎo)早期治療。病變早期以肝脾為中心，肝氣郁滯、痰瘀阻絡(luò)為主要證候，治療以疏肝理氣、化痰通絡(luò)為法。降濁化瘀合劑中柴胡、枳實(shí)疏肝理氣，茵陳、澤瀉、熟大黃、全栝樓化痰降濁，丹參活血通絡(luò)，共奏疏肝理氣、化痰通絡(luò)之效，臨床應(yīng)用取得良好療效。

從本實(shí)驗(yàn)中可以看出，模型組大鼠血清 TC、TG、LDL-C和 FFA明顯高于正常組，且 FBG、FINS升高，HOMA-IR顯著升高，證實(shí) T2DN合并非酒精性脂肪肝大鼠血脂代謝紊亂和 IR的存在;模型組HDL-C較正常組升高，可能是高 TC血癥所引起。與模型組比較，中藥治療組TG、TC、FFA明顯改善，且TG、FFA改善程度優(yōu)于西藥組。中藥組FBG較模型組雖無變化，但HOMA-IR降低，證實(shí)降濁化瘀合劑有改善IR的作用。

綜上所述，我們成功建立了T2DM并NAFLD的大鼠模型，降濁化瘀合劑治療T2DM合并NAFLD有改善IR和脂代謝的作用，有利于改變IR與脂代謝紊亂相互影響的惡性循環(huán)。

［1］ 王 倩，管小琴.大鼠非酒精性脂肪肝造模方法的改進(jìn)［J］.世界華人消化雜志，2007，15(11):1219-1224.

［2］ 胡愛民，肖鳳英，鄭 云.2型糖尿病并脂肪肝實(shí)驗(yàn)性大鼠模型的建立及評(píng)價(jià)［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2006，14(3):156-159.

［3］ Li z，Soloski MJ，Diehl AM.Dietary factors alter hePatic innate immune system in mice with nonaicoholic fatty liver disease［J］.Hepatology 2005，42:880-885.

［4］ Samuel VT，Liu ZX，Qu X，et al.Mechanism of hepatic insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease［J］.J Biol Chem，2004，279:32345-32353.

［5］ Ginsberg HN，Zhang YL，Hemandez-Ono A.Regulation of plasma triglycerides in insulin resistance and diabetes［J］.Arch Med Res，2005，36:232-240.