李 寧 周曉靚 施培基 王 浩 王榮先

放療增敏劑是目前腫瘤治療研究領域較熱門的一類藥物，一些增敏效果較好的藥物如硝基咪唑類由于具有神經(jīng)毒性而限制了其臨床應用[1]。煙酰胺是近年來研究較多的放射增敏劑，與Carbogen氣體（95%O2+5%CO2）合用增敏效果更好，且毒性低[2-4]。Qin等[5]以煙酰胺為母體化合物通過結構改造，合成了比母體化合物增敏作用更好、毒性更低的一系列化合物。但由于煙酰胺吡啶環(huán)的空間位阻作用，使這類煙酰氨基酸衍生物的合成較困難并且收率較低。本研究通過結構改造，在這類化合物基礎上利用電子等排原理設計合成出了新型吡啶丙烯酸衍生物，即N-[3-（3-吡啶基）丙烯?；鵠-2-氨基丁酸，并應用噻唑藍比色法（MTT實驗）及集落形成實驗觀察該化合物對體外HeLa細胞的增敏作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 3-吡啶丙烯酸（sigma公司）；2-氨基丁酸乙酯鹽酸鹽（中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所藥物室合成）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、1-羥基苯并三唑（HOBt）購自上海共價化學科技有限公司；磁共振氫譜用Varian Mercury Vx-300磁共振儀測定，TMS為內(nèi)標；熔點用BUCHI 535測定（熔點未校正）；HeLa細胞由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 化合物制備 錐形瓶中依次加入447 mg（0.003 mol）3-吡啶丙烯酸，671 mg（0.004 mol）2-氨基丁酸乙酯鹽酸鹽，800 mg（0.004 mol）EDC·HCl，540 mg（0.004 mol）HOBt，30 mL二氯甲烷，稍微搖勻后加入干燥重蒸后的三乙胺1.2 mL，室溫電磁攪拌5 h后過濾，依次用蒸餾水（12 mL×1次）、碳酸氫鈉飽和溶液（12 mL×3次）、蒸餾水（12 mL×3次）洗滌二氯甲烷反應液，再用無水硫酸鈉干燥過夜。蒸除二氯甲烷，得到黃白色粉末，用乙酸乙酯-環(huán)己烷重結晶。將所得固體與3 mL 2.5%氫氧化鈉水溶液完全反應，用濃鹽酸調(diào)pH至4～5，析出白色沉淀，過濾干燥后即得產(chǎn)品。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 設有氧培養(yǎng)組和乏氧培養(yǎng)組。HeLa細胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，乏氧培養(yǎng)組于照射前30 min置于充有氮氣的密閉容器中培養(yǎng)。

1.2.3 MTT實驗 取對數(shù)生長期的HeLa細胞，胰酶消化計數(shù)將2×107/L細胞接種于96孔板，每孔200 μL，貼壁培養(yǎng)12 h后，分別加1、2、4、8、16、32 mmol/L濃度的藥液，每種濃度設平行3孔，設不加藥的培養(yǎng)基（含血清）為空白對照。加藥培養(yǎng)12 h及24 h后每孔加入25 μL（5 g/L）MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。乏氧培養(yǎng)組在每個培養(yǎng)周期最后30 min置于氮氣中培養(yǎng)。吸出培養(yǎng)液加入150 μL的DMSO，振搖5 min，用酶標儀于492 nm波長測吸光度，計算細胞抑制率=1-（實驗組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。

1.2.4 集落形成實驗 根據(jù)不同照射劑量接種不同細胞數(shù)于6孔板，每個劑量組分別設有氧單純照射組、有氧照射+給藥組、乏氧單純照射組及乏氧照射+給藥組，每種劑量設平行3孔。給藥組培養(yǎng)12 h后加入藥液，孵育24 h后（乏氧組于照射前在氮氣中培養(yǎng)30 min）按不同劑量照射。照射采用137Cs（Gammacell 40，加拿大產(chǎn)）γ射線進行照射，劑量率0.807 Gy/ min，設計照射劑量為0、1、2、3、4、6、8 Gy。照射后1 h更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6 d。吸出培養(yǎng)液，加甲醇固定3 min，0.1%結晶紫染色2 min，顯微鏡下計數(shù)克隆形成數(shù)（含有≥50個細胞的集落），取平行3孔的平均數(shù)計算集落形成率。利用軟件sigmaplot 10，采用多靶單擊模型S=1-(1-e-D/D0)N,在半對數(shù)坐標上以照射劑量為橫坐標，細胞生存分數(shù)的對數(shù)值為縱坐標，擬合細胞存活曲線，并根據(jù)Dq=D0/lnN計算該化合物的放射增敏參數(shù)，得出放射增敏比（SER）。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用成組t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 化合物合成結果 N-[3-（3-吡啶基）丙烯酰基]-2-氨基丁酸為白色粉末，總收率78%，純度99.2%，熔點為225℃～226℃（分解），結構式見圖1。1H-NMR（DMSO）：δ=0.916（t,3H,-CH3）,1.743（m, 2H,-CH2-）,4.270（m,1H,-NH-）,6.852（d,1H,-HC=C（α）H-）,7.463（d,1H,-H（β）C=CH-）,7.967（d,1H,5-H pyr）,8.406（d,1H,4-H pyr）,8.540（s,1H,6-H pyr）, 8.744（s,1H,2-H pyr）,12.647（s,1H,-COOH）。MS： C12H14N2O3,M+=234.1(計算值為234.1)。

2.2 MTT實驗結果 加藥培養(yǎng)12 h組的細胞抑制率無明顯規(guī)律，24 h組結果顯示N-[3-（3-吡啶基）丙烯?；鵠-2-氨基丁酸作用于HeLa細胞抑制率隨藥物濃度的增加而增強，相關數(shù)據(jù)見表1、2。各藥物濃度抑制率24 h組與12 h組相比差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。根據(jù)24 h組結果得到該化合物有氧條件下對Hela細胞的50%細胞死亡所需藥物濃度（IC50）和20%細胞死亡所需藥物濃度（IC20）分別為12.30和1.66 mmol/L，乏氧條件下分別為8.37和1.32 mmol/L。采用化合物的IC20作為放射增敏實驗的藥物濃度。

表1 有氧條件下不同藥物濃度的細胞抑制率（n=3,%±s）

表1 有氧條件下不同藥物濃度的細胞抑制率（n=3,%±s）

＊＊P＜0.01

藥物濃度（mmol/L） 12 h 24 h t -33.949＊＊77.623＊＊44.837＊＊54.347＊＊24.174＊＊57.681＊＊012481 6 32 0.00 2.22±0.11 13.48±0.14 15.16±0.89 10.42±0.55 24.20±1.09 19.71±0.96 0.00 8.32±0.29 29.64±0.33 47.49±0.87 32.00±0.41 56.49±2.04 80.52±1.55

表2 乏氧條件下不同藥物濃度的細胞抑制率（n=3,%，±s）

表2 乏氧條件下不同藥物濃度的細胞抑制率（n=3,%，±s）

＊＊P＜0.01

藥物濃度（mmol/L） 12 h 24 h t -45.262＊＊37.985＊＊32.614＊＊36.161＊＊55.130＊＊50.833＊＊012481 6 32 0.00 1.03±0.24 3.17±0.09 12.53±0.41 20.70±0.86 28.19±1.03 23.03±1.09 0.00 11.32±0.31 37.50±1.56 49.61±1.93 52.61±1.27 67.17±0.66 83.25±1.74

2.3 HeLa細胞的放射增敏實驗結果 照射后HeLa細胞集落形成能力隨照射劑量的增加而下降，且在同一照射劑量，照射+給藥組集落形成率明顯低于單純照射組，乏氧培養(yǎng)組集落形成率明顯低于相應有氧培養(yǎng)組,見圖2。根據(jù)“多靶單擊模型”計算出N-[3-（3-吡啶基）丙烯?；鵠-2-氨基丁酸對HeLa細胞的有氧放射增敏比為1.44，乏氧放射增敏比為1.84。說明該化合物可增加HeLa細胞的放射敏感性，多靶單擊模型主要參數(shù)見表3。

圖2 照射存活曲線

表3 多靶單擊模型主要參數(shù)

3 討論

本研究采用MTT實驗測定N-[3-（3-吡啶基）丙烯酰基]-2-氨基丁酸對HeLa細胞的毒性，文獻報道煙酰氨基酸衍生物IC50為10 mmol/L[5]，因此本實驗以該濃度為依據(jù)設計不同濃度（1、2、4、8、16、32 mmol/L）進行MTT實驗。實驗中測定加藥培養(yǎng)12 h和24 h后細胞存活率，以測定藥物對HeLa細胞的毒性作用，結果顯示加藥孵育24 h后作用較明顯，故采用該時間為照射前細胞培養(yǎng)的最佳時間，N-[3-（3-吡啶基）丙烯?；鵠-2-氨基丁酸在體外實驗中對HeLa細胞的毒性作用較小，有氧培養(yǎng)組和乏氧培養(yǎng)組IC50分別為12.30 mmol/L和8.37 mmol/L。為了降低藥物的細胞毒性對實驗的影響，通常采用藥物的IC20作為給藥劑量進行照射實驗,因此增敏實驗采用藥物濃度為有氧組1.66 mmol/L，乏氧組1.32 mmol/L。

本研究顯示有氧培養(yǎng)和乏氧培養(yǎng)組中，照射+給藥組Dq、D0值均小于單純照射組，可知該化合物對有氧和乏氧的HeLa細胞均有增敏作用。照射增敏實驗中，乏氧培養(yǎng)組所用藥物濃度小于有氧培養(yǎng)組，但其放射增敏比（1.84）明顯高于有氧培養(yǎng)組（1.44），表明其對乏氧細胞有較好的增敏作用。

煙酰胺是輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的組成部分，廣泛分布于體內(nèi)，導致煙酰胺作為放療增敏劑使用時腫瘤靶向性較差[6]。有研究表明煙酰胺側(cè)鏈引入氨基酸得到煙酰胺基酸衍生物可加強其放射增敏作用，可能的機制為藥物通過氨基酸轉(zhuǎn)運途徑到達腫瘤組織，增加了其腫瘤靶向性[7]，但此類化合物的合成過程中需利用疊氮法，毒性較大，合成方法復雜[5]。本實驗合成的N-[3-（3-吡啶基）丙烯?；鵠-2-氨基丁酸是全新化合物，設計原理是在煙酰胺基酸衍生物基礎上引入一個雙鍵側(cè)鏈,增加了其側(cè)鏈長度，從而大大降低了引入氨基酸時吡啶環(huán)的空間位阻作用。與文獻報道的通過疊氮法合成煙酰胺基酸衍生物相比[5]，本實驗未使用活潑試劑，僅在室溫下通過縮合反應和水解反應即可得到產(chǎn)物，反應條件溫和，降低了合成難度，產(chǎn)率較高（78%），與文獻報道的生物結果相當[5],且簡化了合成方法，有較好的應用前景。

本研究合成了N-[3-（3-吡啶基）丙烯?；鵠-2-氨基丁酸，并初步評價了其細胞毒性及其放射增敏作用，證明該化合物對體外HeLa細胞有放射增敏作用，但其增敏機制還有待進一步深入研究。

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