龔慧賓 沈中陽 宋紅麗 鄭衛(wèi)萍 董 沖 宋曉靜 張 靜

肝移植目前已被公認為是治療各種終末期肝病的有效手段，但供體的短缺影響了肝移植的進程，活體肝移植為終末期肝病患者帶來了希望，尤其是成人右半肝活體肝移植擴大了供肝體積，從而減少了因供肝體積不足帶來的問題[1]。然而供體殘肝體積不足導(dǎo)致的肝功能衰竭的風(fēng)險很大，其中肝細胞損傷及再生延遲是影響活體肝移植療效的重要因素之一。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mes?enchymal stem cells，BMSCs）具有向肝細胞分化的潛能和自我更新能力，是目前細胞治療組織工程領(lǐng)域的熱點[2-3]。本實驗旨在研究BMSCs是否能促進擴大肝葉切除后殘肝的肝細胞再生及修復(fù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 提取BMSCs的大鼠為：4～5周齡SPF級Wistar大鼠，體質(zhì)量100～120 g。動物模型用大鼠為：6～8周齡SPF級Wistar大鼠，體質(zhì)量200～220 g。均購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑及儀器 二甲基亞砜和胰蛋白酶（Sigma公司），培養(yǎng)液為DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Gibco公司），Percoll淋巴細胞分離液（Amersham Bioscience公司）。小鼠抗大鼠的CD34-PE、CD44-PE、CD90-FIT、CD29-FITC抗體和細胞周期試劑盒（BD公司）。增殖細胞核抗原（prolifera?tion cell nuclear antigens，PCNA）免疫組化試劑盒（武漢博士德公司），Beckman全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 BMSCs的提取、純化及鑒定 （1）BMSCs的提取和純化：5%水合氯醛腹腔注射麻醉，75%乙醇浸泡3 min，無菌環(huán)境下取脛骨和股骨，原代培養(yǎng)用DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，將骨髓細胞懸液以1∶1的比率覆蓋于密度為1 073 g/L的Percoll淋巴細胞分離液上層，離心收集中間白膜層細胞，PBS液洗2遍，用含10%胎牛血清DMEM/F12重懸。以1×108/L細胞密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，48 h首次換液，待細胞接近融合80%時加入0.25%胰蛋白酶消化，以1∶2傳代。通過貼壁培養(yǎng)方法，每次換液棄除懸浮細胞，從而使BMSCs得到純化。（2）BMSCs的鑒定：取生長良好的第3代細胞，消化、計數(shù)，使細胞濃度為5×109/L，分別加入5 μL的抗體CD34、CD44、CD90及CD29，同時用PBS作為陰性對照，冰浴30 min后，行流式細胞儀檢測。表達CD90、CD29及CD44而不表達CD34者為BMSCs。

1.2.2 80%肝切除大鼠模型的建立 取36只雄性Wistar大鼠，半開放式乙醚吸入麻醉，上腹橫切口入腹，離斷鐮狀韌帶、左三角韌帶及肝胃韌帶，采用中線3-0線雙線結(jié)扎法分別結(jié)扎左葉、中葉以及尾狀葉，以減少術(shù)中出血。留右葉和三角葉，即為80%肝切除手術(shù)[4]，術(shù)中注意止血徹底。

1.2.3 細胞移植 根據(jù)預(yù)實驗的大鼠存活率選擇實驗組和對照組的例數(shù)，以確保術(shù)后存活各個時間段的大鼠數(shù)量一致，將80%肝切除模型大鼠采用隨機數(shù)字表法分為實驗組（n=16）和對照組（n=20），實驗組于術(shù)后即刻取預(yù)先消化的BMSCs，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為2×108/L，用肝素化的1 mL注射器取1 mL細胞懸液經(jīng)門靜脈注射，對照組給予等量無菌生理鹽水，分別于術(shù)后1、3及7 d各處死5只，留取血液和肝組織。

1.2.4 肝細胞增殖方法及結(jié)果判定 （1）流式細胞儀檢測：取部分新鮮肝臟組織研磨，透過200目濾網(wǎng)制備單細胞懸液，用細胞周期試劑盒按照說明書進行染色、上機，采用流式細胞技術(shù)檢測細胞周期，比較S期細胞所占比例。（2）免疫組化法：觀察PCNA的表達水平，計算PCNA指數(shù)具體方法為每張切片隨機讀取10個視野，光鏡400倍下計數(shù)PCNA陽性細胞數(shù)[5]，PCNA指數(shù)=PCNA陽性細胞數(shù)/全部肝細胞數(shù)（每個視野）×100%。

1.2.5 肝細胞修復(fù)相關(guān)檢測 （1）生化檢測：分別檢測血清中的谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平。（2）組織HE染色：HE染色觀察肝臟組織學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，全部數(shù)據(jù)處理均以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察及表型鑒定 （1）形態(tài)學(xué)觀察：剛接種的細胞鏡下呈大小較均一的圓形，胞膜清晰，胞體透亮。接種48 h后可見細胞貼壁，貼壁生長的BMSCs散在分布，開始呈圓形，部分細胞有偽足伸展，呈橢圓形、紡錘形、梭形或多角形。8～10 d后80%以上細胞融合。傳代細胞生長迅速，約6 d細胞融合，見圖1。（2）表型鑒定：75.36%的細胞表達CD29、CD44及CD90，不表達CD34，為BMSCs，見圖2。

圖2 BMSCs的鑒定

2.2 生存率比較 實驗組80%肝切除術(shù)后生存15只，1只死于感染；對照組生存15只，5只均在術(shù)后24 h內(nèi)死亡，死因主要是感染（1只）、彌漫性腸系膜下出血（1只）、腹水（2只）和膽汁淤積（1只）。

2.3 肝組織HE染色 實驗組術(shù)后1、3和7 d時肝臟組織顯示肝竇輕度擴張，較少的炎性細胞浸潤，少見壞死，壞死程度明顯輕于對照組，術(shù)后3 d差異尤為明顯；對照組術(shù)后3 d，肝臟組織HE染色可見肝竇擴張明顯，大量炎性細胞浸潤，大量片狀壞死，細胞氣球樣變，見圖3。

圖3 大鼠80%肝切除術(shù)后3 d時肝臟病理改變（HE×400）

2.4 BMSCs對肝功能的影響 大鼠80%肝切除術(shù)后，實驗組和對照組ALT、AST水平于術(shù)后1 d達最高峰，以后逐漸下降，但實驗組下降水平明顯高于對照組。實驗組術(shù)后1、3和7 d時ALT、AST水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），見表1。

2.5 BMSCs對殘肝細胞周期的影響 實驗組術(shù)后7 d時G0/G1期和術(shù)后3 d時G2/M期細胞所占比例均低于對照組，術(shù)后1、3和7 d時S期細胞所占比例高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），見表2。

2.6 BMSCs對細胞增殖的影響 術(shù)后3 d實驗組肝細胞PCNA水平達高峰，實驗組術(shù)后不同時間PCNA表達水平高于對照組（均P＜0.01），見圖4、表3。

表12 組術(shù)后不同時間ALT和AST水平（n=5，IU/L，±s）

表12 組術(shù)后不同時間ALT和AST水平（n=5，IU/L，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，表2、3同

組別 ALT術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d對照組實驗組t 2 270.05±209.37 1 248.07±149.13 4.346＊＊560.90±26.25 157.17±15.56 3.086＊110.17±19.97 41.25±8.27 4.632＊＊組別對照組實驗組t AST術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d 1 670.67±230.14 747.35±140.14 3.841＊＊633.57±80.07 279.50±29.95 3.812＊＊281.12±39.62 103.87±16.67 3.943＊＊

表2 2組術(shù)后不同時間細胞周期的變化（n=5，%，±s）

表2 2組術(shù)后不同時間細胞周期的變化（n=5，%，±s）

組別 G0/G1期術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d對照組實驗組t 64.45±15.13 56.72±10.76 1.040 51.83±10.76 63.45±5.82 0.836 68.36±25.09 56.93±7.66 3.011＊組別對照組實驗組t G2/M期術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d 28.29±14.32 33.33±9.72 0.554 39.66±3.81 19.46±3.78 7.720＊＊28.20±17.00 33.33±7.76 0.518組別對照組實驗組t S期術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d 3.45±1.87 9.75±0.10 3.680＊＊7.24±0.83 11.22±1.20 5.116＊＊8.51±0.42 16.47±3.64 5.429＊＊

表3 2組術(shù)后不同時間殘肝組織PCNA水平變化（n=5，%，±s）

表3 2組術(shù)后不同時間殘肝組織PCNA水平變化（n=5，%，±s）

組別 術(shù)后1 d 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d實驗組對照組t 24.62±2.92 13.42±0.55 7.515＊＊56.65±7.48 30.25±2.58 6.665＊＊7.42±1.60 3.55±0.75 6.468＊＊

3 討論

小肝綜合征是一種發(fā)生在擴大肝切除或減體積肝臟移植后的臨床綜合征。Heaton[6]對因部分肝臟移植或由于腫瘤行擴大肝葉切除術(shù)后小肝綜合征定義為：由于植入的肝臟體積或擴大肝葉切除后殘肝體積過小而導(dǎo)致功能上不能滿足受體的需求，從而出現(xiàn)的一種臨床綜合征。其臨床表現(xiàn)為：術(shù)后持續(xù)性膽汁淤積、凝血機制紊亂、門靜脈高壓、腹水、持續(xù)性肝臟功能異常、膿毒血癥、胃腸出血等并發(fā)癥。組織學(xué)特征為：肝細胞呈氣球樣變、脂肪變性，膽汁瘀積形成膽栓，缺血性斑片狀壞死區(qū)和增生區(qū)并存。部分肝臟移植物或擴大肝葉切除后殘肝可以通過肝細胞再生的方式滿足所需要的體積，但是在肝臟再生之前，殘肝體積＜35%時術(shù)后發(fā)生肝功能衰竭的可能性很大。在臨床上，出于對供體安全的考慮，多數(shù)供者只能提供有限體積移植肝臟，即所謂的小體積移植物，而對于肝臟腫瘤的患者，大多數(shù)已經(jīng)存在肝硬化的基礎(chǔ)病變，同樣不能耐受擴大肝葉的切除手術(shù)，這種矛盾是導(dǎo)致小肝綜合征發(fā)生的重要原因[7]。本實驗構(gòu)建80%肝切除大鼠模型，通過門靜脈注射BMSCs，發(fā)現(xiàn)BMSCs能顯著促進肝再生及修復(fù)，其機制可能與BMSCs與肝再生關(guān)系密切有關(guān)。BMSCs是一種比較原始的骨髓基質(zhì)細胞，具有能夠自我更新和多向分化的潛能[8]，在適宜的條件下可被誘導(dǎo)分化成各種組織細胞，包括肝細胞[9]。BMSCs具有基質(zhì)細胞的特性，能夠分泌各種細胞因子，促進肝再生[10-11]。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)門靜脈途徑注射BMSCs能顯著改善急性肝損傷小鼠肝功能[12]。

大鼠70%肝切除術(shù)后7 d殘肝再生可恢復(fù)到正常大小，出現(xiàn)小肝綜合征的比率低[13]，切除90%為極限體積，術(shù)后平均生存時間僅12 h[14]，無法觀察BM?SCs對小體積殘肝的修復(fù)和再生作用，故本實驗選擇80%肝切除模型。

本研究發(fā)現(xiàn)BMSCs作用于80%肝切除大鼠后，實驗組各時間段血ALT、AST水平明顯低于對照組，提示BMSCs能促進肝功能恢復(fù)；細胞增殖周期中S期細胞比例高于對照組，說明肝細胞再生快于對照組。實驗組肝細胞PCNA水平于術(shù)后3 d達高峰，隨后逐減低。實驗組1、3和7 d時PCNA表達水平均明顯增高，提示BMSCs能促進肝細胞增殖?？傊?，BMSCs可以促進大鼠80%肝切除肝再生及修復(fù)，提高生存率。

[1]潘光棟,嚴律南.成人活體右半肝移植和小肝綜合征[J].國際外科學(xué)雜志,2006,33(4):256-259.

[2]Jiang Y,Jahagirdar BN,Reinhard RL,et al.Pluripotency of mesen chymal stem cells derived from adult marrow[J].Nature,2002,6 (4):879-880.

[3]Miyazkai M,Masaka T,Akiyma I,et al.Propagation of adult rat bone marrow-derived hepatocyte-like cells by serial passages in vi?tro[J].Cell Trsnsplantion,2004,13(4):385-391.

[4]Caub J,Iversen J.Rat liver regeneration after 90%partial hepatecto?my[J].Hepatology,1984,4(5):902-904.

[5]Yao XM,Zhao J,Li Y,et al.Effect of bicyclol on liver regeneration after partial hepatectomy in rat[J].Dig Dis Sci,2009,54(4): 774-781.

[6]Heaton N.Small-for-size liver syndrome after auxiliary and split liv?er transplantation:donor selection[J].Liver Transplantion,2003,9 (9):26-28.

[7]Kiuchi T,Tanaka K,Ito T,et al.Small-for-size graft in living donor liver transplantation:how far should we go[J]？Liver Transpl,2003, 9(9):S29-35.

[8]Fiegel HC,Lioznov MV,Cortes-Dericks L,etal.Liver-specific gene expression in cultured human hepmatopoietic stem cell[J].Stem Cell,2003,21(1):98-104.

[9]Awital I,Inderbitzin D,Aoki T,et al.Isolation characterization and transplantation of bone marrow derived hepatocyte stem cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2001,288(1):156-164.

[10]李文晰,段芳齡.骨髓干細胞向肝細胞分化分化研究[J].胃腸病學(xué)和肝臟學(xué)雜志,2003,12(1):5-7.

[11]展玉濤,陳洪松.骨髓干細胞在大鼠肝再生環(huán)境中的分化[J].臨床肝膽病雜志,2002,6(3):158-160.

[12]劉銀娣,楊云生,王韞芳，等.經(jīng)門靜脈骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療小鼠急性肝損傷療效[J].中華肝病雜志,2008,16(9): 688-691．

[13]張海山,房學(xué)東,張德恒,等.術(shù)前不同缺血對大鼠80%肝切除的影響[J].中國實驗診斷學(xué)，2002,6(3):158-160.

[14]譚浩翔,高毅,陳建峰.人鼠骨髓間充質(zhì)干細胞移植在大鼠肝再生衰竭中的作用[J].中華肝臟病雜志,2003,15(6):473-474.