張國強 程 毅 李 玲 高順強

近年來，復方甘草酸苷被廣泛用于皮膚病和肝病的治療，臨床研究顯示復方甘草酸苷對斑禿治療有效[1-2]。糖皮質激素應用于斑禿治療已有60余年，是目前治療斑禿最為常用、可靠及有效的方法之一，2種藥物的主要機制可能與抗炎及免疫抑制有關。本研究旨在觀察復方甘草酸苷和地塞米松對人毛乳頭細胞生長的影響，為臨床篩選刺激毛囊及毛發(fā)生長的藥物提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）標本來源：正常人頭皮取自我院2009—2010年神經外科手術患者，年齡20～40歲，無系統(tǒng)性疾病，頭皮標本離體6 h以內。（2）主要試劑和儀器：分離酶、膠原酶D、L-谷氨酰胺、噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司，DMEM購自美國Hyclone公司，鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體購自美國Neomarker公司，胎牛血清購自杭州四季青生物材料有限公司，復方甘草酸苷購自日本美能發(fā)源制藥公司，地塞米松購自鄭州卓峰制藥有限公司。倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司，酶標儀購自鄭州博塞生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 毛乳頭細胞的分離培養(yǎng) 人毛乳頭細胞采用兩步酶消化分離法[3],分離得到純化的人毛乳頭細胞加含10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)基混勻后，以每培養(yǎng)瓶30～50個毛乳頭的密度接種。待毛乳頭貼壁后換液，去除未貼壁的單個細胞及雜質。分離出的毛乳頭3 d后90%貼壁，貼壁1 d后可觀察到細胞遷出呈放射狀生長，2～3周后細胞大部分生長融合。

1.2.2 毛乳頭細胞的鑒定 取第2代毛乳頭細胞，0.25%胰酶消化、傳代至放有蓋玻片的6孔板，5%CO2溫箱37℃孵育24 h，收取蓋玻片，4%多聚甲醛固定15 min，4℃過夜。用α-平滑肌肌動蛋白單抗作為一抗對毛乳頭細胞進行染色，按S-P法介紹的步驟進行。以PBS代替一抗作為陰性對照，胞漿出現(xiàn)黃色顆粒為(+)，棕色顆粒為(++)，褐色顆粒為(+++)。

1.2.3 噻唑藍（MTT）法檢測藥物對人毛乳頭細胞增殖活性的影響 取對數(shù)生長期的第3代人毛乳頭細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，以105的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，待細胞貼壁后吸取培養(yǎng)基，設空白對照組和實驗組，實驗組又分為復發(fā)甘草酸苷組和地塞米松組，實驗組每孔加入含不同濃度藥物(0.5、1、2.5、5、10、20、50、100 mg/L)的10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基100 μL，每個濃度6個復孔，空白對照組只加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，每孔加入5 mg/L的MTT 10 μL，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h后棄上清液，每孔加入DMSO 200 μL，避光條件下充分震蕩，酶標儀于波長492 nm處測定各孔吸光度值(A492)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，多個樣本兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化染色結果 α-平滑肌肌動蛋白在人毛乳頭細胞中為陽性表達，呈細絲狀沿細胞長軸分布，見圖1。

圖1 人毛乳頭細胞α-平滑肌肌動蛋白表達（免疫組化×200）

2.2 藥物干預對人毛乳頭細胞增殖的影響 （1）復方甘草酸苷干預結果：處于對數(shù)生長期的第3代毛乳頭細胞加入不同濃度的復方甘草酸苷培養(yǎng)72 h后，普通光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)未見明顯差異。MTT結果顯示各濃度組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=3.627，P＜0.05），與對照組相比，10、20、50 mg/L均能明顯促進細胞增殖（P分別為0.025、0.002、0.003）。在0.5～20 mg/L濃度范圍內，促增殖作用逐漸增強，濃度再增加，其促增殖作用反而減弱，見圖2。（2）地塞米松干預結果：處于對數(shù)生長期的第3代毛乳頭細胞加入不同濃度的地塞米松培養(yǎng)72 h后，普通光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)未見明顯差異。MTT結果顯示各濃度組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=3.045，P＜0.05），與對照組相比，1、2.5 mg/L均能明顯促進細胞增殖（P分別為0.004和0.001）。在0.5～2.5 mg/L濃度內，促增殖作用逐漸增強，濃度再增加，其促增殖作用有所減弱，見圖3。在倒置顯微鏡下觀察經2種藥物處理的細胞，復方甘草酸苷組較地塞米松組細胞生長狀態(tài)好，胞漿更為豐富。

圖2 不同濃度復方甘草酸苷對人毛乳頭細胞增殖的影響

圖3 不同濃度地塞米松對人毛乳頭細胞增殖的影響

3 討論

甘草是傳統(tǒng)中藥養(yǎng)發(fā)生發(fā)產品中使用頻率較高的藥物和添加成分，復方甘草酸苷的主要成分為甘草酸苷，即β-甘草酸，并復方了甘氨酸及半胱氨酸（片劑為蛋氨酸），具有多種藥理作用。因其具有抗超敏反應、抗炎癥的作用，在皮膚科領域常被用于治療多種過敏性皮膚疾病，近來多項臨床研究顯示其對斑禿治療有效[1-2]，且體外毛囊培養(yǎng)證明甘草提取物對毛發(fā)生長有促進作用[4]。糖皮質激素給藥方法有外用、局部注射和系統(tǒng)給藥，其作用機制主要與抗炎及免疫抑制有關，其中局部注射是較為安全有效的方法之一，該法在國外通常作為局限性斑禿治療的首選[5]，并且在美國皮膚病學委員會指南報告中被列為斑禿的首選治療方案[6]。以往對這2種藥物作用于斑禿作用機制的研究大都集中在其抗炎、免疫抑制方面。Thornton等[7]發(fā)現(xiàn)糖皮質激素作用于毛乳頭細胞的機制與雌激素及其β受體有關。有文獻報道，斑禿患者皮損部位的毛囊總數(shù)減少，生長期毛囊則明顯減少甚至消失，多數(shù)毛囊為退行期、休止期改變，毛乳頭縮小、消失[8]。本研究表明復方甘草酸苷和地塞米松分別能在一定濃度范圍內刺激毛乳頭細胞增殖。2種藥物在抗炎、免疫調節(jié)的同時還可能調節(jié)了毛乳頭細胞的活性，進而通過多種細胞因子、生長因子如成纖維細胞生長因子7等，調節(jié)毛囊上皮細胞，并促進毛母質細胞增殖分化，最終誘導毛發(fā)生長[9]，提示尋找能夠增強毛乳頭細胞活性的藥物將是治療各類脫發(fā)性疾病的又一切入點。在倒置顯微鏡下可見復方甘草酸苷處理的細胞較地塞米松生長狀態(tài)好，胞漿更為豐富。推測在治療脫發(fā)性疾病方面，復方甘草酸苷可能較傳統(tǒng)的糖皮質激素更有優(yōu)勢。

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