馬全玲 武大偉 魏殿軍 張堅(jiān)磊 胡靜儀

整合子（integron）是上世紀(jì)80年代在對(duì)耐藥質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子進(jìn)行系統(tǒng)研究的過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)的。常見(jiàn)的耐藥整合子分為5類(lèi)，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)相關(guān)研究較多。整合子本身無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)移，但常常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)座子及接合性質(zhì)粒上，這種情況提高了耐藥基因盒擴(kuò)散的能力[1]。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合酶基因的特異性引物，采用PCR和DNA序列分析方法測(cè)定本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌整合子存在的狀況及類(lèi)型，結(jié)合已檢測(cè)的耐藥基因，應(yīng)用多基因聚類(lèi)分析的方法對(duì)臨床分離株進(jìn)行親緣性分析，以了解其在天津地區(qū)的流行情況。

1 材料與方法

1.1 材料 2008年2月—2009年2月收集分離自天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院、天津市第一中心醫(yī)院及天津市環(huán)湖醫(yī)院的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌共55株。采用K-B法測(cè)定14種抗菌藥物的敏感性，判定標(biāo)準(zhǔn)按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）2007年的標(biāo)準(zhǔn)。醫(yī)院內(nèi)感染診斷標(biāo)準(zhǔn)參照衛(wèi)生部2001年《醫(yī)院感染管理規(guī)范》診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)3種及3種以上不同種類(lèi)抗菌藥物耐藥的菌株判定為多重耐藥株。標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.2 模板DNA的提取 按文獻(xiàn)[2]操作。整合酶基因及可變區(qū)引物的合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，各種靶基因引物序列和目的產(chǎn)物長(zhǎng)度，見(jiàn)表1。

表1 整合酶基因及可變區(qū)引物序列

1.3 整合酶基因及整合子可變區(qū)的PCR擴(kuò)增 （1）整合酶基因的PCR擴(kuò)增：對(duì)55株多重耐藥株分別進(jìn)行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合酶基因的PCR擴(kuò)增。Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)、Ⅲ類(lèi)整合酶基因檢測(cè)的反應(yīng)條件相同，參照參考文獻(xiàn)[3]。（2）整合酶基因陽(yáng)性株整合子可變區(qū)的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）-PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系（50 μL）為One shot LA PCRTMMix 25 μL，上下游引物（25 pmol）各1 μL,模板DNA 3 μL，剩余體積用滅菌去離子水補(bǔ)足，94℃5 min,94℃45 s,47℃45 s,72℃1 min,72℃10 min，進(jìn)行35次循環(huán)。對(duì)可變區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶HinfⅠ進(jìn)行RFLP分型。

1.4 觀察指標(biāo) PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用紫外透射儀進(jìn)行初步分析，陽(yáng)性結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)拍照。把整合子可變區(qū)擴(kuò)增片段大小相同且RFLP顯示同一帶型的可變區(qū)片段認(rèn)為具有相同的DNA序列[4]。PCR產(chǎn)物的純化、克隆均按試劑盒說(shuō)明操作后，將連有目的基因的重組質(zhì)粒送往上海英駿公司進(jìn)行正反向測(cè)序，在GenBank上進(jìn)行BLAST分析后確定可變區(qū)含有的基因盒類(lèi)型。

1.5 多基因聚類(lèi)分析菌株間親緣性（Average法） 參照參考文獻(xiàn)[5]，用1來(lái)代表特異性基因擴(kuò)增的片段條帶存在，用0來(lái)代表特異性基因擴(kuò)增的片段條帶不存在，把55株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌已檢測(cè)過(guò)的各種基因檢測(cè)數(shù)據(jù)收集起來(lái)組成一個(gè)原始數(shù)據(jù)矩陣，采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析以獲得菌株間親緣性分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 整合酶基因和可變區(qū)的檢測(cè) 55株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌共檢出47株含有Ⅰ類(lèi)整合酶基因,在所入選的藥物中，整合酶基因陽(yáng)性株耐藥率明顯高于整合酶基因陰性株,見(jiàn)表1。其中47株Ⅰ類(lèi)整合酶基因陽(yáng)性株中有23株檢出可變區(qū)結(jié)構(gòu)，未檢出Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合酶基因，可變區(qū)的PCR產(chǎn)物共有2個(gè)片段長(zhǎng)度：1 500 bp（4株）和2 000 bp（19株）,見(jiàn)圖1、2。對(duì)其用HinfⅠ進(jìn)行酶切后，發(fā)現(xiàn)1 500 bp可變區(qū)RFLP顯示同一帶型；2 000 bp可變區(qū)RFLP也顯示同一帶型，見(jiàn)圖3、4。

表2 Ⅰ類(lèi)整合子陽(yáng)性株與陰性株耐藥率比較 株（%）

圖1 1 500 bp可變區(qū)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖3 1 500 bp可變區(qū)RFLP電泳結(jié)果

圖2 2 000 bp可變區(qū)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖4 2 000 bp可變區(qū)RFLP電泳結(jié)果

2.2 可變區(qū)PCR產(chǎn)物測(cè)序 BLSAT網(wǎng)上比對(duì)分析結(jié)果顯示，1 500 bp可變區(qū)含有arr-3和aacA4 2個(gè)基因盒；2 000 bp可變區(qū)含有aacA4、catB8及aadA1 3個(gè)基因盒。

2.3 多基因聚類(lèi)分析菌株間親緣性 見(jiàn)圖5。55株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中主要存在3種克隆株，Ⅰ：53、54、1、45、50、37、41、9及36號(hào)菌株均攜帶TEM、ADC、intⅠ1基因;Ⅱ：18、20、7、10及12號(hào)菌株均攜帶ADC基因;Ⅲ：48、51、2、34、35、31、32、25、27、23、14、21、22、17、19、15、16、13、14、8、11、4及6號(hào)菌株均攜帶ADC和intⅠ1基因，39、40、38號(hào)菌株攜帶TEM、ADC、intⅠ1、OXA-23及IMP-2基因，30、46、26號(hào)菌株攜帶intⅠ1基因，33、43、5號(hào)菌株未發(fā)現(xiàn)攜帶本實(shí)驗(yàn)所研究的基因。其中，Ⅰ和Ⅱ組有交叉均含有ADC基因，Ⅰ和Ⅲ也有交叉均含有intⅠ1基因等，它們之間具有親緣關(guān)系。

3 討論

整合子由1個(gè)編碼整合酶的intⅠ基因、2個(gè)基因重組位點(diǎn)attI和attC、啟動(dòng)子和基因盒構(gòu)成，目前已知的2組整合子包括:耐藥整合子（resistant-integrons, RI）和超級(jí)整合子（super-integrons,SI）。耐藥整合子位于轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒及染色體，幾乎所有編碼抗微生物耐藥的耐藥基因均來(lái)自耐藥整合子。根據(jù)整合酶基因序列不同，耐藥整合子可分為5類(lèi)，Ⅰ類(lèi)整合子主要存在于Tn21及與Tn21類(lèi)似轉(zhuǎn)座子上，Ⅱ類(lèi)整合子常與Tn7相關(guān)，Ⅲ類(lèi)整合子僅在少數(shù)腸桿菌科如沙雷氏菌中可檢出。有報(bào)道Ⅳ、Ⅴ類(lèi)整合子在其他菌中存在[1]。本研究結(jié)果顯示，47株鮑曼不動(dòng)桿菌Ⅰ類(lèi)整合酶基因擴(kuò)增陽(yáng)性，陽(yáng)性率為85.5%（47/55），未測(cè)到Ⅱ、Ⅲ類(lèi)整合酶基因，與Hall等[6]報(bào)道在不動(dòng)桿菌中Ⅰ類(lèi)整合子最常見(jiàn)相符。

整合子可變區(qū)基因盒由耐藥基因和attC(59 bp)組成，在整合子中已發(fā)現(xiàn)100多種基因盒[7]，編碼的耐藥基因覆蓋了大多數(shù)目前正在使用的抗菌藥物。本研究對(duì)整合酶基因陽(yáng)性株進(jìn)行可變區(qū)PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示有23株可變區(qū)陽(yáng)性，共檢測(cè)出2種Ⅰ類(lèi)整合子系統(tǒng)，片段長(zhǎng)度為1 500 bp和2 000 bp。其中4株出現(xiàn)1 500 bp條帶，測(cè)序結(jié)果為arr-3，aacA4；19株出現(xiàn)2 000 bp條帶，測(cè)序結(jié)果為aacA4，catB8，aa?dA1，它們分別是氨基糖苷類(lèi)、氯霉素、利福平類(lèi)耐藥的基因，其中aacA4，catB8，aadA1這一基因盒組合在國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道[8]。另外，本研究中整合子可變區(qū)并未檢測(cè)出磺胺類(lèi)耐藥基因，但藥敏結(jié)果卻顯示整合子與該類(lèi)抗生素耐藥的有關(guān)，考慮原因可能是由于整合子陽(yáng)性菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物的耐藥還有另外的影響因素，即在Ⅰ類(lèi)整合子的3′保守區(qū)含有一個(gè)磺胺類(lèi)耐藥基（sul1），故攜帶Ⅰ類(lèi)整合子的菌株就可介導(dǎo)對(duì)磺胺類(lèi)抗菌藥物的耐藥。

本研究中未發(fā)現(xiàn)喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的耐藥基因位于整合子可變區(qū)中，但藥敏表型上整合子陽(yáng)性株耐藥率比陰性株耐藥率顯著增高，可能是與細(xì)菌染色體DNA的基因突變有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，同一類(lèi)耐藥基因aacA4可在不同菌株間檢出，表明在藥物持續(xù)選擇壓力下，不僅耐藥基因盒上耐藥基因本身發(fā)生變異，也促使整合子整合其他耐藥基因，耐藥基因盒在不同菌株間移動(dòng)，造成細(xì)菌耐藥性的變化，甚至造成多重耐藥。此前筆者曾預(yù)測(cè)整合子上存在OXA-23或IMP-1、IMP-2基因，但結(jié)果顯示該類(lèi)基因未處于整合子上，考慮正是這2類(lèi)基因未能快速大范圍擴(kuò)散的原因。

本研究結(jié)果顯示，整合子可變區(qū)的PCR擴(kuò)增陽(yáng)性率（23/55，41.8%）沒(méi)有整合酶基因PCR擴(kuò)增陽(yáng)性率高（47/55，85.5%），有24株未能擴(kuò)增出可變區(qū)結(jié)構(gòu)，與國(guó)外相關(guān)研究報(bào)道相似[9]，可能原因是基因盒片段過(guò)長(zhǎng)不能有效擴(kuò)增，常規(guī)PCR擴(kuò)增有效的產(chǎn)物大小應(yīng)在2～3 kb以?xún)?nèi)，而有些整合子可變區(qū)含多個(gè)耐藥基因盒超過(guò)有效擴(kuò)增范圍，且若一株菌內(nèi)同時(shí)存在2個(gè)以上大小片段不等的整合子結(jié)構(gòu)，則PCR擴(kuò)增時(shí)可能僅擴(kuò)出小片段整合子;另外，若整合子3-CS引物相應(yīng)序列缺失造成無(wú)法擴(kuò)增，也可造成假陰性結(jié)果。

本研究結(jié)果表明，攜帶3種基因、攜帶1種基因及攜帶2種基因的3種鮑曼不動(dòng)桿菌為流行株（3個(gè)克隆），它們均攜帶intⅠ1基因，提示intⅠ1可與其他耐藥基因同時(shí)存在一個(gè)流行株中；另外，這些菌株均已被公認(rèn)為院內(nèi)感染菌株，亦提示本研究中流行株的出現(xiàn)是由于院內(nèi)感染所致。同時(shí)，每個(gè)克隆所含菌株耐藥表型不盡相同，且它們分離自不同醫(yī)院，表明克隆株在醫(yī)院間存在交叉?zhèn)鞑?，需要臨床醫(yī)生和微生物工作者給予足夠重視。

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