李朝平,路艷清
(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科教研室,蘭州 730000;2.甘肅省平?jīng)龈叩柔t(yī)學(xué)??茖W(xué)校,平?jīng)?744000)
通乳散癖湯對(duì)乳腺增生病模型大鼠乳腺組織Bcl-2、PCNA表達(dá)的影響*
李朝平1,路艷清2
(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科教研室,蘭州 730000;2.甘肅省平?jīng)龈叩柔t(yī)學(xué)??茖W(xué)校,平?jīng)?744000)
[目的]檢測(cè)抗凋亡基因(Bcl-2)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)基因表達(dá)與乳腺增生病組織學(xué)的相關(guān)性,通過(guò)乳腺增生病癌變趨勢(shì)的生物學(xué)指標(biāo)研究探討通乳散癖湯對(duì)乳腺增生病的干預(yù)治療作用。[方法]采用苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮腹腔注射誘導(dǎo)建立乳腺增生病大鼠模型,分別用通乳散癖湯高、中、低劑量和對(duì)照藥乳癖消灌胃治療。免疫組化檢測(cè)各組大鼠乳腺組織標(biāo)本中Bcl-2、PCNA的表達(dá)情況。[結(jié)果]通乳散癖湯能夠調(diào)整實(shí)驗(yàn)大鼠乳腺組織Bcl-2、PCNA的表達(dá)水平。[結(jié)論]通乳散癖湯可能是通過(guò)抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)凋亡,從而實(shí)現(xiàn)抑制乳腺增生的作用。
通乳散癖湯;乳腺增生??;大鼠
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療本病目前尚無(wú)特效療法,中醫(yī)學(xué)在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下依據(jù)辨證論治原則臨床治療本病取得了滿意效果。通乳散癖湯經(jīng)臨床驗(yàn)證具有良好效果,但其機(jī)制、環(huán)節(jié)、最佳用藥劑量及對(duì)乳腺增生病干預(yù)治療作用等尚不清楚,為此設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康未孕Wistar雌性大鼠(蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)60只,體質(zhì)量150~180 g,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑
1.1.2.1 中藥及中成藥 通乳散癖湯是李朝平教授在臨床應(yīng)用多年的經(jīng)驗(yàn)方,經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證,能有效消除乳房疼痛、腫塊、溢乳等乳腺增生病的癥狀、體征,臨床效果顯著。其組方(仙茅、仙靈脾、鹿角霜、郁金、柴胡、浙貝母、川楝子、山慈菇各10 g,夏枯草、王不留行各15 g,天門冬20 g);乳癖消片(遼寧好護(hù)士藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn))。
1.1.2.2 西藥 苯甲酸雌二醇 (天津金耀氨基酸有限公司);黃體酮注射液(浙江仙居制藥有限公司生產(chǎn))。
1.1.2.3 試劑 抗凋亡基因(Bcl-2)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組化試劑盒(博士德生物技術(shù)公司生產(chǎn))等。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
從“畫(huà)家”“操縱者”“創(chuàng)造性叛逆”者等比喻可見(jiàn),這一時(shí)期的譯學(xué)研究賦予了譯者前所未有的自由,充分肯定了譯者在翻譯中所起的重要作用,使其主體性得到進(jìn)一步彰顯。
1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后將60只Wistar大鼠稱取體質(zhì)量后按隨機(jī)數(shù)字表分為:空白對(duì)照組(A)、模型組(B)、乳癖消藥物對(duì)照組(C)、通乳散癖湯低劑量組(D)、通乳散癖湯中劑量組(E)、通乳散癖湯高劑量組(F),每組各10只。經(jīng)檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量無(wú)顯著性差異。
1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟、流程
1.2.2.1 藥品制備 本實(shí)驗(yàn)所涉及中藥的劑量是根據(jù)臨床對(duì)患者用藥取得最好療效劑量,參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人之間體表面積比例與劑量換算[2]。按人(60 kg)單位體質(zhì)量(kg)用藥的8倍作為大鼠單位體質(zhì)量用藥,確定為中劑量,低劑量為中劑量的1/2,高劑量為中劑量的1倍,依據(jù)上述計(jì)算得出通乳散癖湯低、中、高劑量單位體質(zhì)量大鼠每天生藥用總量分別為:8.6、17.2、34.4 g/kg。其分別相當(dāng)于臨床有效治療量的0.5倍、1倍、2倍。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將生藥用自來(lái)水浸過(guò)藥液面3 cm,浸泡30 min后用大火燒開(kāi),后改為小火煎30 min,取藥液,置2倍以上容器內(nèi)儲(chǔ)存。再加水,量稍少于前次,大火燒開(kāi)后改小火煎煮25min,濾藥液,棄藥渣,混合兩次藥液,慢火濃縮至每只大鼠3 mL/d的體積。每日剩余藥液冷藏,用時(shí)量取各劑量組藥液30 mL,加熱至約20℃。乳癖消片研細(xì)末,單位體質(zhì)量大鼠用藥量為0.768 g/kg,溶于30 mL蒸餾水中,按每只大鼠3 mL/d的體積配制,隨用隨配。
1.2.2.2 造模及給藥 參照文獻(xiàn)報(bào)道的乳腺增生病模型造模方法[3],除A組外其余各組均采用苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮造模。A組腹腔注射生理鹽水0.5 mg/(kg·d),連續(xù)25 d;B、C、D、E、F各組分別腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/(kg·d),連續(xù)20 d,繼而改為黃體酮4 mg/(kg·d),連續(xù)5 d。造模開(kāi)始后的第16天,在造模給藥基礎(chǔ)上同時(shí)給予藥物治療。造模給藥與灌胃藥物治療間隔時(shí)間8 h。A、B兩組實(shí)驗(yàn)大鼠給予蒸餾水灌胃3 mL/(只·d);C組實(shí)驗(yàn)大鼠給予乳癖消片混懸液灌胃3 mL/(只·d)(含乳癖消0.192 g);D組實(shí)驗(yàn)大鼠給予通乳散癖湯低劑量灌胃3 mL/(只·d);E組實(shí)驗(yàn)大鼠給予通乳散癖湯中劑量灌胃3 mL/只·天;F組實(shí)驗(yàn)大鼠給予通乳散癖湯高劑量灌胃3mL/(只·d)。各組實(shí)驗(yàn)大鼠連續(xù)灌胃30d。
考慮到臨床上乳腺增生病患者多在乳腺未發(fā)生明顯病理增生,因乳房脹痛等不適提前就診,故在本實(shí)驗(yàn)中治療干預(yù)在造模開(kāi)始后的第16天同時(shí)給予灌胃治療。筆者認(rèn)為此法既有利于控制實(shí)驗(yàn)條件,也更接近于臨床治療情況。
1.2.3 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前選取大鼠第2對(duì)乳腺組織用8%硫化鈉涂抹于乳房周圍進(jìn)行脫毛處理;于末次灌胃給藥后24 h,切取第2對(duì)乳腺組織,甲醛固定,石蠟包埋切片,送甘肅省人民醫(yī)院病理科行免疫組化法檢測(cè)抗凋亡基因(Bcl-2)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)情況。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均輸入計(jì)算機(jī),采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,各指標(biāo)組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法。當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為組間數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
免疫組化染色結(jié)果判斷:Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞漿著棕黃色,PCNA陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核著棕黃色。所有染色切片在同一條件下應(yīng)用(BI-2000,成都泰盟科技有限公司)彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行相對(duì)灰度值的測(cè)定,隨機(jī)選取5個(gè)最佳視野進(jìn)行拍照(4×100倍)。用(±s)表示每例平均灰度值。通乳散癖湯對(duì)各組大鼠乳腺組織Bcl-2、PCNA的影響見(jiàn)表1。
表1 各組大鼠乳腺組織Bcl-2、PCNA陽(yáng)性表達(dá)(±s)Tab.1 Expression of Bcl-2,PCNA of mammary gland ineach group in rats of each group(±s)
表1 各組大鼠乳腺組織Bcl-2、PCNA陽(yáng)性表達(dá)(±s)Tab.1 Expression of Bcl-2,PCNA of mammary gland ineach group in rats of each group(±s)
注:A組與 B 組比較:ΔP<0.01;各治療組與 B 組比較:*P<0.05,**P<0.01。
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大鼠乳腺組織Bcl-2、PCNA陽(yáng)性表達(dá)水平用平均灰度值表示。由表1可以看出:模型組Bcl-2、PCNA灰度值與空白對(duì)照組進(jìn)行比較,有顯著性差異(P<0.01)說(shuō)明苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮腹腔注射可誘導(dǎo)大鼠乳腺組織增生;治療組與模型組比較結(jié)果顯示Bcl-2、PCNA灰度值隨治療劑量的增加而呈現(xiàn)遞增趨勢(shì),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
研究表明灰度值愈小其陽(yáng)性表達(dá)水平愈高,反之則表達(dá)水平愈低。對(duì)照表1結(jié)果可以得出:Bcl-2、PCNA陽(yáng)性表達(dá)水平隨著給藥劑量的增加而降低。由此筆者得到以下結(jié)論:通乳散癖湯對(duì)于苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮腹腔注射誘導(dǎo)的大鼠乳腺組織增生疾病具有拮抗作用。
3.1 動(dòng)物模型的選擇 本實(shí)驗(yàn)中,選用了抵抗力強(qiáng),對(duì)激素敏感的Wistar大鼠,采用苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮外源性激素腹腔注射方法進(jìn)行造模。本造模方法具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、成功率高的特點(diǎn)。經(jīng)25 d造模,光鏡下可見(jiàn)模型組乳腺小葉、腺泡上皮增生,導(dǎo)管擴(kuò)張,間質(zhì)水腫,腺腔、間質(zhì)以及細(xì)胞核呈病理性改變,說(shuō)明外源性雌激素異常刺激可造成動(dòng)物乳腺增生病理模型,其乳腺病理與人體乳腺增生病理相類似,說(shuō)明筆者已成功復(fù)制了大鼠乳腺增生病理模型。
3.2 關(guān)于對(duì)照藥物的選擇 乳癖消片藥物組成為:鹿角、蒲公英、昆布、夏枯草、雞血藤、三七、赤芍等,具有軟堅(jiān)散結(jié)、活血消痛、清熱解毒功效,用于痰熱互結(jié)所致的乳癖、乳癰。目前此藥物在臨床上較為常用,療效較同類藥物好。在藥物組成上有相似性,均含有鹿角、夏枯草,但乳癖消選用鹿角其具有補(bǔ)腎助陽(yáng),活血散瘀消腫之功,補(bǔ)腎之功較弱,而通乳散癖湯選用鹿角霜具有益腎助陽(yáng),補(bǔ)力雖弱,但不滋膩,且有收斂作用。通乳散癖湯與乳癖消片具有較強(qiáng)的可比性。
3.3 組方分析 通乳散癖湯組成:仙茅、仙靈脾、鹿角霜、郁金、柴胡、浙貝母、川楝子、山慈菇各10 g,夏枯草、王不留行各15 g,天門冬20 g。本方主要針對(duì)乳腺增生病中肝郁腎虛及腎虛沖任失調(diào)證型而設(shè)。乳腺增生“本”在于腎氣不足,沖任失調(diào),肝失所養(yǎng),肝氣郁結(jié);“標(biāo)”在于痰凝、血瘀、氣滯。病機(jī)特點(diǎn)為本虛而標(biāo)實(shí),故治療以調(diào)理沖任,疏肝補(bǔ)腎為主,不忘化痰祛瘀散結(jié)。全方具有補(bǔ)腎助陽(yáng),調(diào)攝沖任,疏肝理氣,養(yǎng)血和營(yíng),化痰軟堅(jiān),調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用,從而調(diào)理沖任,維持女性正常生理平衡,有助于從根本上治療乳腺增生病。
3.4 Bcl-2、PCNA在大鼠乳腺增生病中的表達(dá) 乳腺增生的發(fā)生及逐漸加重的過(guò)程是上皮細(xì)胞增殖過(guò)度和凋亡減弱共同作用的結(jié)果。Bcl-2基因作為細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的重要調(diào)控點(diǎn),成為影響乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞凋亡的重要因素,而PCNA的表達(dá)作為衡量細(xì)胞增殖的可靠指標(biāo)具有特異性[4]。
Bcl-2是種凋亡抑制基因,可抑制多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,并在不影響細(xì)胞增殖情況下增強(qiáng)細(xì)胞存活力,參與細(xì)胞增殖與凋亡動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控,其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡障礙,使遺傳物質(zhì)的突變率增加,從而參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[5]。
PCNA是一種分子量為3 600的核蛋白,是DNA聚合酶δ的輔助蛋白,能較好地反映細(xì)胞進(jìn)入增殖周期的狀況,客觀地評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)速度。
綜合上述可見(jiàn)Bcl-2與PCNA兩者處于動(dòng)態(tài)平衡之中。平衡失調(diào)則導(dǎo)致異常增殖,增殖細(xì)胞容易引起基因突變;而細(xì)胞不能正常凋亡勢(shì)必引起細(xì)胞不斷堆積,最終也易產(chǎn)生惡變。
在實(shí)驗(yàn)中筆者運(yùn)用彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行相對(duì)灰度值的測(cè)定方法,從而取代了依據(jù)染色強(qiáng)度判定陽(yáng)性結(jié)果的方法,較之該法更具有科學(xué)性。平均灰度值的大小與免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)呈負(fù)相關(guān)性,即平均灰度值高者,陽(yáng)性表達(dá)水平低,表明大部分腫瘤細(xì)胞處于G0期或靜止期,DNA復(fù)制不活躍,增殖能力比較弱;相反,平均灰度值低者,陽(yáng)性表達(dá)水平高,腫瘤細(xì)胞大部分處于增殖期,是增殖旺盛的表現(xiàn)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出:Bcl-2與PCNA在正常組織和增生組織中均有分布,通乳散癖湯通過(guò)調(diào)整PCNA、Bcl-2的表達(dá)水平,從而達(dá)到抑制乳腺組織增生的作用,并具有一定的阻斷乳腺增生向惡性轉(zhuǎn)變的作用,最終達(dá)到干預(yù)治療目的。此外,還發(fā)現(xiàn)通乳散癖湯對(duì)乳腺增生病的防治作用呈量效依賴關(guān)系,以高濃度作用顯著。綜上所述:通乳散癖湯能抑制乳腺增生病的進(jìn)一步發(fā)展,具有治療與預(yù)防的雙重作用。由于細(xì)胞凋亡是一很復(fù)雜的多基因素參與、調(diào)控的結(jié)果,所以通乳散癖湯對(duì)乳腺增生病的調(diào)控的機(jī)制不是單因素的,對(duì)其他基因有無(wú)影響,以及是怎樣的影響,有待于今后在臨床和實(shí)驗(yàn)方面進(jìn)行更深入的研究。
[1] 李中玉.乳腺增生病中西醫(yī)診治全書(shū)[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,2004:164-166.
[2] 郝光榮.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].上海:第二軍醫(yī)出版社,2002:276-276.
[3] 饒金才,李蘭珍,陳云生,等.乳腺增生病動(dòng)物模型的復(fù)制及病理類型[J].中國(guó)病理生理雜志,1992,8(6):671-672.
[4] 黃志清.Bcl-2基因及其在乳腺癌中的表達(dá)[J].中國(guó)腫瘤臨床,1996,23(9):667-668.
[5] 闕 秀,董建強(qiáng).乳腺腫物Bcl-2表達(dá)與激素受體的相關(guān)研究[J].診斷病理學(xué)雜志,1997,4(1):25-27.
Effect of Tongru Sanpi decoction on expression of Bcl-2,PCNA of tissue of mammary glands
in rats with hyperplasia of breast glands
LI Chao-ping1,LU Yan-qing2
(1.Gansu College of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China;2.Pingliang Medicine College,Pingliang 744000,China)
[Objective]The aim of the present study was to detect correlation between gene expression of Bcl-2,PCNA and histology of hyperplasia of mammary glands and to explore the intervention therapy of Tongru Sanpitang on hyperplasia of mammary glands by studying the biological indicator of the cancer-changing tendency of hyperplasia of mammary gland.[Methods]Hyperplasia of mammary glands were induced in rats by intraperitonneal injection of Estradiol Benzoate and Progesterone.It was treated respectively by perfusion Tongru Sanpitang(high,middle and low doses)into stomach and in the control drug,Rupixiao was perfused into stomach.Expression of Bcl-2,PCNA in histological specimen of mammary glands in each group in rats was detected with IHC.[Result]Tongru Sanpi decoction could regulate the expression level of Bcl-2,PCNA of mammary glands in experimental rats.[Conclusions]Tongru Sanpi decoction can probably inhibit the hyperplasia of mammary glands by inhibiting cell proliferation and inducing cell apoptosis.
Tongru Sanpi decoction;hyperplasia of mammary glands;rats
R285.5
A
1672-1519(2011)01-0061-03
甘肅省自然科學(xué)基金暨中青年科技基金資助項(xiàng)目(3ZS041-A25-067)。
李朝平(1958-),女,教授,碩士研究生導(dǎo)師,主要從事中醫(yī)婦科學(xué)教學(xué)和臨床研究工作。
路艷清。
2010-07-16)
·臨床報(bào)道·