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        通乳散癖湯對乳腺增生病模型大鼠乳腺組織Bcl-2、PCNA表達的影響*

        2011-02-28 08:38:26李朝平路艷清
        天津中醫(yī)藥 2011年1期
        關鍵詞:乳癖灌胃造模

        李朝平,路艷清

        (1.甘肅中醫(yī)學院婦產(chǎn)科教研室,蘭州 730000;2.甘肅省平?jīng)龈叩柔t(yī)學專科學校,平?jīng)?744000)

        通乳散癖湯對乳腺增生病模型大鼠乳腺組織Bcl-2、PCNA表達的影響*

        李朝平1,路艷清2

        (1.甘肅中醫(yī)學院婦產(chǎn)科教研室,蘭州 730000;2.甘肅省平?jīng)龈叩柔t(yī)學專科學校,平?jīng)?744000)

        [目的]檢測抗凋亡基因(Bcl-2)、增殖細胞核抗原(PCNA)基因表達與乳腺增生病組織學的相關性,通過乳腺增生病癌變趨勢的生物學指標研究探討通乳散癖湯對乳腺增生病的干預治療作用。[方法]采用苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮腹腔注射誘導建立乳腺增生病大鼠模型,分別用通乳散癖湯高、中、低劑量和對照藥乳癖消灌胃治療。免疫組化檢測各組大鼠乳腺組織標本中Bcl-2、PCNA的表達情況。[結(jié)果]通乳散癖湯能夠調(diào)整實驗大鼠乳腺組織Bcl-2、PCNA的表達水平。[結(jié)論]通乳散癖湯可能是通過抑制細胞增殖,誘導凋亡,從而實現(xiàn)抑制乳腺增生的作用。

        通乳散癖湯;乳腺增生??;大鼠

        現(xiàn)代醫(yī)學治療本病目前尚無特效療法,中醫(yī)學在中醫(yī)基礎理論指導下依據(jù)辨證論治原則臨床治療本病取得了滿意效果。通乳散癖湯經(jīng)臨床驗證具有良好效果,但其機制、環(huán)節(jié)、最佳用藥劑量及對乳腺增生病干預治療作用等尚不清楚,為此設計了本實驗。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        1.1.1 實驗動物 成年健康未孕Wistar雌性大鼠(蘭州大學醫(yī)學動物實驗中心提供)60只,體質(zhì)量150~180 g,適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

        1.1.2 實驗藥品與試劑

        1.1.2.1 中藥及中成藥 通乳散癖湯是李朝平教授在臨床應用多年的經(jīng)驗方,經(jīng)反復驗證,能有效消除乳房疼痛、腫塊、溢乳等乳腺增生病的癥狀、體征,臨床效果顯著。其組方(仙茅、仙靈脾、鹿角霜、郁金、柴胡、浙貝母、川楝子、山慈菇各10 g,夏枯草、王不留行各15 g,天門冬20 g);乳癖消片(遼寧好護士藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn))。

        1.1.2.2 西藥 苯甲酸雌二醇 (天津金耀氨基酸有限公司);黃體酮注射液(浙江仙居制藥有限公司生產(chǎn))。

        1.1.2.3 試劑 抗凋亡基因(Bcl-2)、增殖細胞核抗原(PCNA)免疫組化試劑盒(博士德生物技術(shù)公司生產(chǎn))等。

        1.2 實驗方法

        從“畫家”“操縱者”“創(chuàng)造性叛逆”者等比喻可見,這一時期的譯學研究賦予了譯者前所未有的自由,充分肯定了譯者在翻譯中所起的重要作用,使其主體性得到進一步彰顯。

        1.2.1 實驗分組 適應性飼養(yǎng)1周后將60只Wistar大鼠稱取體質(zhì)量后按隨機數(shù)字表分為:空白對照組(A)、模型組(B)、乳癖消藥物對照組(C)、通乳散癖湯低劑量組(D)、通乳散癖湯中劑量組(E)、通乳散癖湯高劑量組(F),每組各10只。經(jīng)檢測各組實驗大鼠體質(zhì)量無顯著性差異。

        1.2.2 實驗步驟、流程

        1.2.2.1 藥品制備 本實驗所涉及中藥的劑量是根據(jù)臨床對患者用藥取得最好療效劑量,參照實驗動物與人之間體表面積比例與劑量換算[2]。按人(60 kg)單位體質(zhì)量(kg)用藥的8倍作為大鼠單位體質(zhì)量用藥,確定為中劑量,低劑量為中劑量的1/2,高劑量為中劑量的1倍,依據(jù)上述計算得出通乳散癖湯低、中、高劑量單位體質(zhì)量大鼠每天生藥用總量分別為:8.6、17.2、34.4 g/kg。其分別相當于臨床有效治療量的0.5倍、1倍、2倍。實驗過程中將生藥用自來水浸過藥液面3 cm,浸泡30 min后用大火燒開,后改為小火煎30 min,取藥液,置2倍以上容器內(nèi)儲存。再加水,量稍少于前次,大火燒開后改小火煎煮25min,濾藥液,棄藥渣,混合兩次藥液,慢火濃縮至每只大鼠3 mL/d的體積。每日剩余藥液冷藏,用時量取各劑量組藥液30 mL,加熱至約20℃。乳癖消片研細末,單位體質(zhì)量大鼠用藥量為0.768 g/kg,溶于30 mL蒸餾水中,按每只大鼠3 mL/d的體積配制,隨用隨配。

        1.2.2.2 造模及給藥 參照文獻報道的乳腺增生病模型造模方法[3],除A組外其余各組均采用苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮造模。A組腹腔注射生理鹽水0.5 mg/(kg·d),連續(xù)25 d;B、C、D、E、F各組分別腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/(kg·d),連續(xù)20 d,繼而改為黃體酮4 mg/(kg·d),連續(xù)5 d。造模開始后的第16天,在造模給藥基礎上同時給予藥物治療。造模給藥與灌胃藥物治療間隔時間8 h。A、B兩組實驗大鼠給予蒸餾水灌胃3 mL/(只·d);C組實驗大鼠給予乳癖消片混懸液灌胃3 mL/(只·d)(含乳癖消0.192 g);D組實驗大鼠給予通乳散癖湯低劑量灌胃3 mL/(只·d);E組實驗大鼠給予通乳散癖湯中劑量灌胃3 mL/只·天;F組實驗大鼠給予通乳散癖湯高劑量灌胃3mL/(只·d)。各組實驗大鼠連續(xù)灌胃30d。

        考慮到臨床上乳腺增生病患者多在乳腺未發(fā)生明顯病理增生,因乳房脹痛等不適提前就診,故在本實驗中治療干預在造模開始后的第16天同時給予灌胃治療。筆者認為此法既有利于控制實驗條件,也更接近于臨床治療情況。

        1.2.3 標本采集 實驗結(jié)束前選取大鼠第2對乳腺組織用8%硫化鈉涂抹于乳房周圍進行脫毛處理;于末次灌胃給藥后24 h,切取第2對乳腺組織,甲醛固定,石蠟包埋切片,送甘肅省人民醫(yī)院病理科行免疫組化法檢測抗凋亡基因(Bcl-2)、增殖細胞核抗原(PCNA)表達情況。

        1.3 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均輸入計算機,采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(±s)表示,各指標組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法。當P<0.05時認為組間數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        免疫組化染色結(jié)果判斷:Bcl-2陽性表達為細胞漿著棕黃色,PCNA陽性表達為細胞核著棕黃色。所有染色切片在同一條件下應用(BI-2000,成都泰盟科技有限公司)彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行相對灰度值的測定,隨機選取5個最佳視野進行拍照(4×100倍)。用(±s)表示每例平均灰度值。通乳散癖湯對各組大鼠乳腺組織Bcl-2、PCNA的影響見表1。

        表1 各組大鼠乳腺組織Bcl-2、PCNA陽性表達(±s)Tab.1 Expression of Bcl-2,PCNA of mammary gland ineach group in rats of each group(±s)

        表1 各組大鼠乳腺組織Bcl-2、PCNA陽性表達(±s)Tab.1 Expression of Bcl-2,PCNA of mammary gland ineach group in rats of each group(±s)

        注:A組與 B 組比較:ΔP<0.01;各治療組與 B 組比較:*P<0.05,**P<0.01。

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        大鼠乳腺組織Bcl-2、PCNA陽性表達水平用平均灰度值表示。由表1可以看出:模型組Bcl-2、PCNA灰度值與空白對照組進行比較,有顯著性差異(P<0.01)說明苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮腹腔注射可誘導大鼠乳腺組織增生;治療組與模型組比較結(jié)果顯示Bcl-2、PCNA灰度值隨治療劑量的增加而呈現(xiàn)遞增趨勢,有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

        研究表明灰度值愈小其陽性表達水平愈高,反之則表達水平愈低。對照表1結(jié)果可以得出:Bcl-2、PCNA陽性表達水平隨著給藥劑量的增加而降低。由此筆者得到以下結(jié)論:通乳散癖湯對于苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮腹腔注射誘導的大鼠乳腺組織增生疾病具有拮抗作用。

        3 討論

        3.1 動物模型的選擇 本實驗中,選用了抵抗力強,對激素敏感的Wistar大鼠,采用苯甲酸雌二醇聯(lián)合黃體酮外源性激素腹腔注射方法進行造模。本造模方法具有操作簡單、重復性好、成功率高的特點。經(jīng)25 d造模,光鏡下可見模型組乳腺小葉、腺泡上皮增生,導管擴張,間質(zhì)水腫,腺腔、間質(zhì)以及細胞核呈病理性改變,說明外源性雌激素異常刺激可造成動物乳腺增生病理模型,其乳腺病理與人體乳腺增生病理相類似,說明筆者已成功復制了大鼠乳腺增生病理模型。

        3.2 關于對照藥物的選擇 乳癖消片藥物組成為:鹿角、蒲公英、昆布、夏枯草、雞血藤、三七、赤芍等,具有軟堅散結(jié)、活血消痛、清熱解毒功效,用于痰熱互結(jié)所致的乳癖、乳癰。目前此藥物在臨床上較為常用,療效較同類藥物好。在藥物組成上有相似性,均含有鹿角、夏枯草,但乳癖消選用鹿角其具有補腎助陽,活血散瘀消腫之功,補腎之功較弱,而通乳散癖湯選用鹿角霜具有益腎助陽,補力雖弱,但不滋膩,且有收斂作用。通乳散癖湯與乳癖消片具有較強的可比性。

        3.3 組方分析 通乳散癖湯組成:仙茅、仙靈脾、鹿角霜、郁金、柴胡、浙貝母、川楝子、山慈菇各10 g,夏枯草、王不留行各15 g,天門冬20 g。本方主要針對乳腺增生病中肝郁腎虛及腎虛沖任失調(diào)證型而設。乳腺增生“本”在于腎氣不足,沖任失調(diào),肝失所養(yǎng),肝氣郁結(jié);“標”在于痰凝、血瘀、氣滯。病機特點為本虛而標實,故治療以調(diào)理沖任,疏肝補腎為主,不忘化痰祛瘀散結(jié)。全方具有補腎助陽,調(diào)攝沖任,疏肝理氣,養(yǎng)血和營,化痰軟堅,調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用,從而調(diào)理沖任,維持女性正常生理平衡,有助于從根本上治療乳腺增生病。

        3.4 Bcl-2、PCNA在大鼠乳腺增生病中的表達 乳腺增生的發(fā)生及逐漸加重的過程是上皮細胞增殖過度和凋亡減弱共同作用的結(jié)果。Bcl-2基因作為細胞凋亡分子機制的重要調(diào)控點,成為影響乳腺導管上皮細胞凋亡的重要因素,而PCNA的表達作為衡量細胞增殖的可靠指標具有特異性[4]。

        Bcl-2是種凋亡抑制基因,可抑制多種因素誘導的細胞凋亡,并在不影響細胞增殖情況下增強細胞存活力,參與細胞增殖與凋亡動態(tài)平衡的調(diào)控,其介導的細胞凋亡障礙,使遺傳物質(zhì)的突變率增加,從而參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[5]。

        PCNA是一種分子量為3 600的核蛋白,是DNA聚合酶δ的輔助蛋白,能較好地反映細胞進入增殖周期的狀況,客觀地評估腫瘤細胞增殖和生長速度。

        綜合上述可見Bcl-2與PCNA兩者處于動態(tài)平衡之中。平衡失調(diào)則導致異常增殖,增殖細胞容易引起基因突變;而細胞不能正常凋亡勢必引起細胞不斷堆積,最終也易產(chǎn)生惡變。

        在實驗中筆者運用彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行相對灰度值的測定方法,從而取代了依據(jù)染色強度判定陽性結(jié)果的方法,較之該法更具有科學性。平均灰度值的大小與免疫組化陽性細胞表達數(shù)呈負相關性,即平均灰度值高者,陽性表達水平低,表明大部分腫瘤細胞處于G0期或靜止期,DNA復制不活躍,增殖能力比較弱;相反,平均灰度值低者,陽性表達水平高,腫瘤細胞大部分處于增殖期,是增殖旺盛的表現(xiàn)。從實驗結(jié)果中可以看出:Bcl-2與PCNA在正常組織和增生組織中均有分布,通乳散癖湯通過調(diào)整PCNA、Bcl-2的表達水平,從而達到抑制乳腺組織增生的作用,并具有一定的阻斷乳腺增生向惡性轉(zhuǎn)變的作用,最終達到干預治療目的。此外,還發(fā)現(xiàn)通乳散癖湯對乳腺增生病的防治作用呈量效依賴關系,以高濃度作用顯著。綜上所述:通乳散癖湯能抑制乳腺增生病的進一步發(fā)展,具有治療與預防的雙重作用。由于細胞凋亡是一很復雜的多基因素參與、調(diào)控的結(jié)果,所以通乳散癖湯對乳腺增生病的調(diào)控的機制不是單因素的,對其他基因有無影響,以及是怎樣的影響,有待于今后在臨床和實驗方面進行更深入的研究。

        [1] 李中玉.乳腺增生病中西醫(yī)診治全書[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2004:164-166.

        [2] 郝光榮.實驗動物學[M].上海:第二軍醫(yī)出版社,2002:276-276.

        [3] 饒金才,李蘭珍,陳云生,等.乳腺增生病動物模型的復制及病理類型[J].中國病理生理雜志,1992,8(6):671-672.

        [4] 黃志清.Bcl-2基因及其在乳腺癌中的表達[J].中國腫瘤臨床,1996,23(9):667-668.

        [5] 闕 秀,董建強.乳腺腫物Bcl-2表達與激素受體的相關研究[J].診斷病理學雜志,1997,4(1):25-27.

        Effect of Tongru Sanpi decoction on expression of Bcl-2,PCNA of tissue of mammary glands
        in rats with hyperplasia of breast glands

        LI Chao-ping1,LU Yan-qing2
        (1.Gansu College of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,China;2.Pingliang Medicine College,Pingliang 744000,China)

        [Objective]The aim of the present study was to detect correlation between gene expression of Bcl-2,PCNA and histology of hyperplasia of mammary glands and to explore the intervention therapy of Tongru Sanpitang on hyperplasia of mammary glands by studying the biological indicator of the cancer-changing tendency of hyperplasia of mammary gland.[Methods]Hyperplasia of mammary glands were induced in rats by intraperitonneal injection of Estradiol Benzoate and Progesterone.It was treated respectively by perfusion Tongru Sanpitang(high,middle and low doses)into stomach and in the control drug,Rupixiao was perfused into stomach.Expression of Bcl-2,PCNA in histological specimen of mammary glands in each group in rats was detected with IHC.[Result]Tongru Sanpi decoction could regulate the expression level of Bcl-2,PCNA of mammary glands in experimental rats.[Conclusions]Tongru Sanpi decoction can probably inhibit the hyperplasia of mammary glands by inhibiting cell proliferation and inducing cell apoptosis.

        Tongru Sanpi decoction;hyperplasia of mammary glands;rats

        R285.5

        A

        1672-1519(2011)01-0061-03

        甘肅省自然科學基金暨中青年科技基金資助項目(3ZS041-A25-067)。

        李朝平(1958-),女,教授,碩士研究生導師,主要從事中醫(yī)婦科學教學和臨床研究工作。

        路艷清。

        2010-07-16)

        ·臨床報道·

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