王富文 徐國萍 應(yīng)學(xué)翔 林燕蘋 何萍青

脆性組氨酸三聯(lián)體基因(fragile histidine triad gene，F(xiàn)HIT)是1996年由Ohta等［1］用定位克隆及外顯子捕獲技術(shù)在人類3號染色體短臂3p14.2首先克隆出來的，其改變主要見于上皮起源的人類惡性腫瘤，以缺失為主。作為腫瘤抑制基因，它的缺失或失活將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展和惡性度的升高。乳腺癌FHIT基因結(jié)構(gòu)或表達異常在國外已有報道，研究表明，F(xiàn)HIT在人類許多腫瘤組織或細胞系中呈現(xiàn)高頻率異常［2］，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。乳腺癌的發(fā)生往往經(jīng)歷1個從上皮增生、不典型增生、原位癌，最終發(fā)展成浸潤癌的過程［3］，而FHIT蛋白與乳腺癌傳統(tǒng)預(yù)后指標及其它生物學(xué)指標的關(guān)系尚不十分清楚。本課題通過研究Fhit蛋白在乳腺良、惡性疾病組織中的表達，并對其與乳腺癌臨床病理指標之間的關(guān)系進行分析，來評估FHIT在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集上海市第六人民醫(yī)院2009年8月～2010年8月經(jīng)穿刺活檢或外科手術(shù)切除且經(jīng)病理檢查確診的具有完整臨床病理資料的女性乳腺手術(shù)標本96例，其中以42例浸潤性導(dǎo)管癌、8例導(dǎo)管內(nèi)癌作為惡性組，年齡35～85歲(中位年齡56歲)，術(shù)前均未行化療、放療和(或)內(nèi)分泌治療。以另外16例導(dǎo)管上皮不典型增生、30例乳腺病作為良性對照組。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

采用SP法，主要步驟為:二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，3%雙氧水室溫處理10 min，PBS緩沖液洗滌，專用微波爐進行抗原修復(fù)，正常山羊血清37℃封閉、一抗4℃冰箱過夜，次日順序滴加二抗及三抗，DAB顯色10～15 min，蘇木精復(fù)染胞核，脫水透明并用中性樹膠封片。兔抗人FHIT多克隆抗體及SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。每次實驗均以Fhit蛋白在正常乳腺組織中表達作陽性對照。

1.3 結(jié)果判斷標準

對Fhit蛋白在組織中表達水平進行病理學(xué)觀察，以細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色染色為Fhit蛋白表達陽性，參考Gatalica［4］的 H-score(H=I× P)系統(tǒng)對實驗結(jié)果進行半定量判定:染色強度(I):依次為0分(無染色)，1分(淡黃色)，2分(棕黃色)，3分(棕褐色)。染色范圍(P):以染色細胞數(shù)所占比例分為無陽性細胞或陽性細胞數(shù)≤10%記為0分，陽性細胞數(shù)為11% ～50%記為1分，陽性細胞數(shù)為51% ～75%記為2分，陽性細胞數(shù)＞75%記為3分。按下列公式計算Fhit蛋白陽性細胞百分率:Fhit蛋白表達細胞陽性率=陽性細胞數(shù)/觀察細胞數(shù)×100%(每張切片在200倍光學(xué)顯微鏡下按順序找5～10個視野，每個視野數(shù)100個細胞)。標準判定:0～3分為表達明顯減弱或陰性(-);4～6分為表達陽性(+);7～9分為表達強陽性(++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)輸入計算機并應(yīng)用SAS6.12軟件進行分析。采用秩和檢驗、Spearman等級相關(guān)處理。檢驗水準α=0.05(雙側(cè))，P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FHIT在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中表達情況

Fhit蛋白主要分布于正常乳腺導(dǎo)管、腺泡上皮及癌細胞胞質(zhì)中。在42例浸潤性導(dǎo)管癌中，有24例(57.1%)Fhit蛋白表達為陰性或明顯減弱，與良性對照組中Fhit蛋白表達陰性或明顯減弱(7/46)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0001)。在8例乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織中，F(xiàn)hit蛋白表達陰性或明顯減弱為4例(50.0%)，與良性對照組中Fhit蛋白表達陰性或明顯減弱(7/46)相比，差異也有顯著性(P=0.043)。在乳腺上皮增生發(fā)展為癌的過程中，F(xiàn)hit蛋白表達水平逐漸降低(P ＜0.01)，見表1。

表1 乳腺良、惡性組織中Fhit表達情況

2.2 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中Fhit蛋白的表達與臨床病理指標的關(guān)系

本組42例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌標本中，F(xiàn)hit蛋白表達陽性率與年齡、腫塊大小、組織學(xué)分級無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期有關(guān)，見表2。

Fhit與 ER、PR、Cerb-B2、p53 在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中表達的相互關(guān)系見表3，其中將Fhit表達(-)的試驗標本歸為Fhit陰性，F(xiàn)hit表達(+)和(++)的試驗標本歸為Fhit陽性。由表可知，42例患者中Fhit蛋白的表達與Cerb-B2的表達呈負相關(guān)，γs=-0.357(P＜0.05);Fhit蛋白的表達與p53的表達呈正相關(guān)，γs=0.411(P ＜0.01);與 ER、PR 的表達無明顯相關(guān)。

表2 42例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌腫FHIT蛋白表達與臨床病理指標的關(guān)系

表3 Fhit與ER、PR、Cerb-B2、P53在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌腫表達的相關(guān)性分析

3 討論

研究表明，在許多腫瘤組織中或腫瘤細胞株中，F(xiàn)HIT基因呈現(xiàn)多發(fā)性、廣泛性的純合性或雜合性缺失，提示此基因的異?？赡芎湍[瘤的發(fā)生有關(guān)，即為多種腫瘤的候選抑制基因［5］。本研究結(jié)果顯示Fhit蛋白主要分布于正常乳腺導(dǎo)管及腺泡上皮細胞胞質(zhì)中，癌細胞亦見陽性細胞，在癌細胞浸潤的邊緣部分陽性細胞無明顯增加。乳腺病和乳腺導(dǎo)管上皮不典型增生組織中Fhit蛋白表達多為強陽性或陽性表達，乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌和乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Fhit蛋白表達多為明顯減弱或陰性。本研究中 Fhit蛋白在浸潤性導(dǎo)管癌中的陰性表達率(57%)高于導(dǎo)管內(nèi)癌(50%)，且惡性組Fhit表達缺失明顯高于良性對照組(乳腺病、乳腺導(dǎo)管上皮不典型增生)中Fhit的表達缺失。在乳腺上皮增生發(fā)展為癌的過程中，F(xiàn)hit蛋白表達水平逐漸降低(P＜0.01)，提示FHIT缺失在乳腺癌的發(fā)病過程中起重要作用。Gatalica等［4］對乳腺癌進展不同階段的上皮(正常上皮、增生上皮、不典型增生及原位癌、浸潤性導(dǎo)管癌)進行Fhit蛋白表達的檢測時，發(fā)現(xiàn)Fhit蛋白表達的減少存在于增生性病變即乳腺癌發(fā)展的最早時期，而且Fhit蛋白表達的逐漸減少與病變進一步的發(fā)展有關(guān)系，具有明顯的負相關(guān)性，提示由于FHIT表達降低，其抑癌作用減弱，失去了對乳腺上皮增生并發(fā)展成癌的抑制作用，故FHIT表達減少與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)關(guān)系，對乳腺活檢組織進行 Fhit蛋白的檢測可能對乳腺癌的早期診斷及治療有重要意義。

本研究表明，F(xiàn)hit蛋白缺失與浸潤性導(dǎo)管癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，說明 FHIT失活對乳腺癌的分子生物學(xué)行為有重要影響，可能是乳腺癌惡性度增高的標志，這一點與Mady等［6］的研究結(jié)果相一致。但對Fhit蛋白在乳腺癌中表達與臨床病理因素之間的關(guān)系進行分析時，各報道之間有一定的差異，所選取的樣本含量不同、不同種族、群體、遺傳背景及環(huán)境因素可能是造成這些差異的原因。趙坡等［7］對66例乳腺導(dǎo)管癌的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)hit蛋白低表達可能與癌組織浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，但未能闡明其與腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量、患者年齡、激素受體等的關(guān)系。Hayashi等［8］研究了61例乳腺癌的FHIT異常轉(zhuǎn)錄與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果表明FHIT基因異常轉(zhuǎn)錄與年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌、孕激素受體、局部轉(zhuǎn)移、乳腺癌家族史及患者的生活習(xí)慣 (吸煙、飲酒)等無關(guān)?？梢奆HIT表達與乳腺癌的臨床病理特征之間的關(guān)系還存在著不同的觀點，有待進一步深入研究。

總而言之，本研究結(jié)果提示FHIT基因表達產(chǎn)物Fhit蛋白表達水平降低在乳腺癌的發(fā)生和演化中發(fā)揮一定作用，對乳腺增生性疾病進行Fhit蛋白檢測，能在臨床及病理上對這些疾病的性質(zhì)判斷提供幫助。Fhit蛋白低表達或表達缺失者可能具有較高的惡性行為和較差的預(yù)后。聯(lián)合檢測乳腺腫瘤組織中 FHIT、Cerb-B2、p53的表達，有助于對可疑癌進行早期診斷。

［1］Ohta M，Inoue H，Cotticelli MG，et al.The FHIT gene，spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t(3;8)break point，is abnormal in digestive tract cancers〔J〕.Cell，1996，84(4):587.

［2］Siprashrili Z，Sozzi G，Barnes LD，et al.Replacement of Fhit in cancer cells suppresses tumorigenicity〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(25):13771.

［3］Beckmann MW，Niederacher D，Schnurch HG，et al.Multistep cancinogenesis of breast cancer and tumor heterogeneity〔J〕.J Mol Med，1997，75(6):429.

［4］Gatalica Z，Lele SM，Rampy BA，et al.The expression of Fhit protein is related Inversely to disease progression on inpatients with breast carcinoma〔J〕.Cancer，2000，88(6):1378.

［5］盧德成，羅佐杰，冼 晶.腎上腺皮質(zhì)腫瘤增殖抗原和脆性組氨酸二聯(lián)體表達的相關(guān)性及意義〔J〕.中國綜合臨床，2008，24(8):753.

［6］Mady HH，Melhem MF.FHIT protein expression and its relation to apoptosis，tumor histologic grade and prognosis in colorectal adenocarcinoma:an immunohisto chemical and image analysis study〔J〕.Clin Exp Metastasis，2002，19(4):351.

［7］趙 坡，李曉瑛，陳樂真，等.乳腺癌中 FHIT蛋白的低表達與轉(zhuǎn)移的關(guān)系〔J〕.癌癥，2002，21(6):668.

［8］Hayashi S，Tanimoto K，Hajiro-nakanishi K，et al.Abnormal FHIT transcripts in human breast carcinomas:a clinicopathological and epidemiological analysis of 61 Japanese cases〔J〕.Cancer Res，1997，57(10):1981.