朱海超,于世軍,楊康鵑,朱玉琢*

（1.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室,吉林延邊 133000;2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 遺傳系,吉林 長(zhǎng)春 130021）

2型糖尿病合并高血壓是臨床常見(jiàn)的問(wèn)題,合并高血壓機(jī)率高達(dá)30%-50%[1]?；颊咭坏┏霈F(xiàn)高血壓病,并發(fā)癥有加重的表現(xiàn)。研究結(jié)果表明2型糖尿病合并高血壓時(shí)在糖代謝異常及壓力負(fù)荷的雙重刺激下,加重了左心室心肌肥厚和功能受損。與單純高血壓比較,高血壓并存糖尿病患者的左心室及左心室重量增大及主動(dòng)脈增寬,患者心臟結(jié)構(gòu)和功能的異常較單純高血壓和2型糖尿病時(shí)更復(fù)雜和更嚴(yán)重,患者心腦血管疾病發(fā)生率明顯高于單純糖尿病組患者[2-4]。而降低糖尿病患者的血壓可以降低腦卒中發(fā)生率的35%-40%、心肌梗死發(fā)生率的20%-25%及心衰發(fā)生率的50%[5]。因此,尋找和建立有效的糖尿病合并高血壓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和發(fā)病前診斷技術(shù),在臨床上具有重要實(shí)用價(jià)值。本研究旨在探討吉林地區(qū)漢族人內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因第7外顯子單核苷酸（G894T）多態(tài)性與糖尿病合并高血壓的關(guān)系,為臨床早期發(fā)現(xiàn)和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

本研究中所有2型糖尿病患者均來(lái)自吉林大學(xué)第一醫(yī)院的住院和門(mén)診患者,每個(gè)病人都根據(jù)1997年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)（ADA）糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了嚴(yán)格的診斷?？崭寡獫{葡萄糖≥7.0mmol/L或隨機(jī)血漿葡萄糖≥11.1 mmol/L或OGTT試驗(yàn)2小時(shí)血糖≥11.1mmol/L,符合上述標(biāo)準(zhǔn)之一者,在次日復(fù)診仍符合三條標(biāo)準(zhǔn)之一者確診為2型糖尿病患者。高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO的標(biāo)準(zhǔn):收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90mmHg。有明確高血壓病史且長(zhǎng)期服用降壓藥物者也包括在內(nèi)。所有病例按照糖尿病病人是否患有高血壓分為兩組,單純糖尿病患者組和糖尿病伴有高血壓組。單純糖尿病組患者共有 45人,男/女=17/28,平均年齡 48±8.54歲。糖尿病合并高血壓組患者共有35人,男/女=13/22,平均年齡 51±7.46歲。正常對(duì)照組 36例,平均年齡47±8.44歲均來(lái)自吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院藥理基地,均為吉林地區(qū)體檢的健康人?；颊呓M與對(duì)照組均為吉林地區(qū)漢族人,各研究對(duì)象間均無(wú)血緣關(guān)系。所有入選患者的一般情況及臨床資料見(jiàn)表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血樣采集 所有受試對(duì)象均于晨起空腹取靜脈血2m l,2%EDTA抗凝。

1.2.2 基因組DNA的提取 采用DNA抽提試劑盒（Promega北京生物技術(shù)有限公司）快速抽提人外周血中白細(xì)胞基因組DNA,操作方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 聚合酶鏈實(shí)驗(yàn) 利用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo6.0按照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出引物。

eNOS基因第7外顯子894G→T位點(diǎn)引物:上游引 物:5′-CAAGGTGGAGAATGAGGAAAC-3′,下 游 引物:5′-CTTTAGAGGCTCAGGGATGGC-3′。 用 PCR 擴(kuò)增儀,預(yù)變性為94℃,持續(xù)5min;繼之30個(gè)周期,每個(gè)周期中變性94℃持續(xù)1min;退火58℃持續(xù)2 min,延伸 72℃,持續(xù)2 min;循環(huán)結(jié)束后終末延伸72℃,持續(xù)10min。用BanII限制性?xún)?nèi)切酶消化擴(kuò)增產(chǎn)物,反應(yīng)采用20μl的反應(yīng)體系。加樣完畢將上述反應(yīng)液混合均勻,瞬時(shí)離心5 s。蓋好Eppendorf離心管,放入恒溫水浴鍋中,37℃水浴5 h。向管內(nèi)添加10×loading buffer（含1%SDS）2μl,使內(nèi)切酶變性以終止反應(yīng)。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳 用移液器取10μl酶切產(chǎn)物以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。（在80 V電壓下泳動(dòng)30min）,溴化乙錠染色,在透射式紫外線燈下觀察檢測(cè)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

觀察熒光帶并確認(rèn)讀取各樣本基因型,計(jì)算各組eNOS基因型頻率和等位基因頻率,然后經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)。各組間等位基因頻率比較用χ2檢驗(yàn)。用SPSS10.0 forwindows軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 eNOS基因的各基因型鑒定 兩個(gè)位點(diǎn)不同等位基因的判別 894G→T位點(diǎn):經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物得到430 bp,經(jīng)過(guò)BanII內(nèi)切酶酶切后得到312 bp和118 bp兩個(gè)片段,是野生型基因GG;酶切后產(chǎn)物既得到430 bp又得到312 bp和118 bp三條片段是突變型雜合子GT;酶切產(chǎn)物只得到一條片段430bp,是突變型純合子TT,結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 eNOS基因第7外顯子894G→T多態(tài)位點(diǎn) Ban II酶切后2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 基因型頻率和等位基因頻率比較 eNOS基因第7外顯子894G→T位點(diǎn)單純糖尿病組（DM組）,糖尿病合并高血壓組（DM+HP組）和對(duì)照組（NC組）基因型頻率和等位基因頻率分布,見(jiàn)表2。

表2 eNOS基因第7外顯子894G→T位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率分布

3 討論

一氧化氮合酶（eNOS）是生成NO的限速酶。一氧化氮合酶（eNOS）基因位于人染色體的7q35～q36區(qū),長(zhǎng)約21kb,包括26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子?，F(xiàn)已證實(shí)的eNOS基因的多態(tài)位點(diǎn)有10個(gè)。包括:兩個(gè)微衛(wèi)星序列,兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列,6個(gè)單核昔酸多態(tài)性位點(diǎn)。本研究關(guān)注第7外顯子單核苷酸（G894T）多態(tài)性多態(tài)性。

國(guó)內(nèi)外對(duì)eNOS基因G894T多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)系存在著巨大的差異。而對(duì)eNOS基因G894T多態(tài)性與糖尿病合并高血壓的研究很少。本研究按有無(wú)高血壓分為糖尿病合并高血壓組（DM+HP）和單純糖尿病組（DM）時(shí),基因型的分析揭示DM+HP組（GG型51.4%,GT型42.9%,TT型5.7%）較NC組（GG型83.3%,GT型8.3%,TT型8.3%.）分布有明顯差異（P＜0.05）,T等位基因頻率亦有顯著差異（DM+HP組等位基因頻率分別為G型為72.9%,T型為27.1%NC組中等位基因頻率分別為G型為87.5%,T型為12.5%）而DM組（GG型66.7%,ID型28.9%,DD型4.4%）與DM+HP組（GG型51.4%,GT型42.9%,TT型5.7%）和NC組（GG型83.3%,GT型8.3%,TT型8.3%）無(wú)明顯差異（P＞0.05）。T等位基因比較也是沒(méi)有差異（P＞0.05）。

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