韓 冬,徐 煌,李文浩,張成文

（嘉興學院醫(yī)學院,浙江 嘉興 314001）

HER2是一種腫瘤表面抗原,正常成年人的組織中不表達而在多種腫瘤組織中表達[1]。而且HER2的表達與腫瘤的惡性程度及腫瘤患者的預后密切相關(guān)。目前已有針對HER2蛋白的單克隆抗體藥物上市,用作HER2過表達的乳腺癌的治療手段,并展現(xiàn)出良好的臨床療效。人們意識到抑制HER2蛋白,可以抑制其下游的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑,起到控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展的作用,將成為理想的腫瘤治療策略[2]。由于RNAi技術(shù)在實現(xiàn)基因沉默的過程中簡便易行,給人們操縱基因提供了強有力的工具,大大地提升了基因治療的可行性[3]。運用 RNAi技術(shù),在既往的研究中我們構(gòu)建了三個針對HER2基因的 RNA干擾質(zhì)粒,通過實時定量PCR技術(shù)和western blot方法篩選出了HER2基因沉默效率最高的干擾質(zhì)粒HER2-shRNA2。在本研究中我們將進一步研究干擾質(zhì)粒HER2-shRNA2對乳腺癌細胞SKBR-3的HER2基因干擾的生物學效應,主要探討其對腫瘤細胞增殖和凋亡是否存在影響,為進一步研究乳腺癌的基因治療提供實驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細胞系SK-BR-3購自中科院上海細胞庫,RNAi干擾質(zhì)粒HER2-shRNA2由本室構(gòu)建并保存,Lipofectamine2000購自invitrogen公司,RPMI1640細胞培養(yǎng)液購自GIBCO公司,RNase購自TAKARA公司,MTT、胰酶、PBS購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染 人乳腺癌細胞SK-BR-3在RPMI1640 37℃5%CO2條件下培養(yǎng),在細胞長滿80%時進行轉(zhuǎn)染,實驗分三組HER2-shRNA2組（轉(zhuǎn)染高效干擾質(zhì)粒HER2-shRNA2）、RNAi陰性對照組（negative control,轉(zhuǎn)染不針對任何基因的干擾質(zhì)粒）、空白對照組（blank control,不采取任何措施,直接培養(yǎng)）。轉(zhuǎn)染使用Lipofectam ine2000,具體操作步驟按試劑說明書進行。

1.2.2 繪制細胞增殖曲線 分別取生長良好的HER2-shRNA2組、RNAi陰性對照組和空白對照組的三組細胞,用胰酶消化,用細胞培養(yǎng)液懸浮細胞并調(diào)整細胞的數(shù)量為1.0×104/ml,均勻接種于63個培養(yǎng)瓶中;每隔24 h每組進行一次細胞計數(shù),每次每組取三瓶細胞分別計數(shù)取平均值。根據(jù)計數(shù)結(jié)果以時間為橫坐標,以單位細胞數(shù)為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.3 MTT比色法測定轉(zhuǎn)染后細胞的生長抑制率取對數(shù)生長期的乳腺癌細胞SK-BR-3采用胰酶消化后,調(diào)整細胞的濃度為1×105/ml,接種于96孔板中,細胞分為三組,分別為HER2-shRNA2組、RNAi陰性對照組和空白對照組,三組質(zhì)粒各0.2μg分別加Lipofectamine 500μl。各孔加入濃度為5 g/LMTT 20μl,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,吸去上清,每孔加入 DMSO 100 μl,緩慢震蕩10min。每組設(shè)三個復孔,分別測定24 h、48 h、72 h、96 h 4個時間點。用酶標儀檢測各孔的吸光度值（OD490）,按照公式細胞生長抑制率（%）=（1-實驗組/對照組）×100%,計算細胞的生長抑制率。

1.2.4 流式細胞儀檢測凋亡細胞 分別收集各組轉(zhuǎn)染后的細胞1×106個,離心后用PBS懸浮細胞,1 000 rpm離心10min,再清洗兩遍去上清,用70%冷乙醇迅速固定,4℃放置12 h以上后用PBS洗2次,調(diào)整細胞濃度為1×106/ml,用 RNase消化,加入1.5m l PI（5 mg/100 ml）對DNA進行染色?；靹蚝笤诹魇郊毎麅x分析,G1期峰之前出現(xiàn)的亞峰為凋亡細胞峰,結(jié)果以凋亡細胞的百分率表示。

1.2.5 western blot檢測乳腺癌細胞SK-BR-3中PCNA的表達量 將轉(zhuǎn)染48小時后的HER2-shRNA 2組 、negative control、blank control組分別用 PBS 洗三次,用細胞裂解液裂解細胞提取總蛋白,取100μg上樣進行SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后,將膠上的蛋白用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,封閉過夜,依次加入PCNA單克隆抗體、β-actin抗體為一抗和辣根過氧化酶標二抗,用DAB顯色,拍照。

1.2.6 統(tǒng)計分析 實驗結(jié)果應用SPSS 11.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)染狀態(tài) HER2-shRNA2和Negative control組質(zhì)粒中含有的綠色熒光蛋白基因與干擾序列共表達,可作為轉(zhuǎn)染成功的報告蛋白。在轉(zhuǎn)染24小時后觀察到HER2-shRNA2和Negative control組中可見綠色熒光蛋白的表達,說明干擾質(zhì)粒已經(jīng)成功的轉(zhuǎn)到細胞當中。而空白對照組,由于不轉(zhuǎn)染含有表達GFP綠色熒光蛋白的質(zhì)粒,在熒光顯微鏡下沒有觀察到綠色熒光。見圖1。

圖1 培養(yǎng)48 h后各組細胞熒光顯微鏡下形態(tài)（×100）

2.2 計數(shù)法繪制細胞增殖曲線 HER2-shRNA2組細胞增殖速度明顯比RNAi陰性對照組和空白對照組的增殖速度慢,抑制細胞增殖的現(xiàn)象出現(xiàn)的比較早。在培養(yǎng)的第3天出現(xiàn)了顯著差異（P＜0.05）。見圖2 、3。

2.3 MTT檢測細胞生長抑制率 MTT結(jié)果顯示HER2-shRNA2組在490 nm處的吸光度顯著降低,而RNAi陰性對照組和空白對照組吸光度沒有明顯改變,說明沉默HER2基因后在一定程度上抑制了SKBR-3細胞的增殖。由表1中可以看出HER2-shRNA2轉(zhuǎn)染后48 h、72 h、96 h細胞生長抑制率分別為 16.53%、39.03%、65.47%。

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 以空白對照組作為對照HER2-shRNA2組在72 h和96 h的凋亡率分別為10.29%,17.36%,HER2-shRNA2組在72h后出現(xiàn)了明顯的細胞凋亡峰。而blank control組和negative control組相比無顯著性差異。見表2。

圖2 各組細胞增殖曲線

圖3 各組細胞增殖第96h細胞形態(tài)（×100）

表1 MTT法檢測HER2-shRNA2對SK-BR-3細胞增殖的抑制作用

表2 流式細胞檢測細胞凋亡

2.5 western b lot檢測PCNA的表達 增殖細胞核抗原（PCNA）是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標。當細胞增殖旺盛時,細胞中的PCNA表達量會很高;而當細胞增殖受到抑制的時候,PCNA的表達量也會相應下降。western blot的結(jié)果可知HER2-shRNA 2干擾質(zhì)粒組的PCNA表達量下降,表明干擾質(zhì)粒抑制了腫瘤細胞的增殖。見圖4。

3 討論

圖4 western blot檢測不同實驗組PCNA的表達

原癌基因HER2其編碼產(chǎn)物是具有受體酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白,屬于表皮生長因子受體家族的成員。HER2激活后會引起一系列細胞信號轉(zhuǎn)導反應,促進腫瘤細胞的增殖,抑制腫瘤細胞的凋亡以及對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性[4,5]。HER2的過表達常常提示腫瘤的惡性度高及其預后不良[6]。目前已有針對HER2蛋白的單克隆抗體藥物上市,用作HER2過表達的乳腺癌的治療手段,并展現(xiàn)出良好的臨床療效[7,8]。人們意識到抑制HER2在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用,將成為理想的腫瘤治療策略。我們設(shè)想如果能通過RNAi的方法降低HER2在乳腺癌中的表達,將會控制腫瘤細胞的生長及其浸潤速度,為乳腺癌的治療提供新方法。

根據(jù)RNAi技術(shù)特點[9],shRNA和siRNA相比,shRNA在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性大大提高。siRNA在體內(nèi)的半衰期只有數(shù)天,而shRNA的半衰期可以達到數(shù)周甚至數(shù)月。因此研究RNAi的長期生物學效應,必須構(gòu)建可在體內(nèi)長期發(fā)揮作用的干擾質(zhì)粒。我們在既往的研究中構(gòu)建了三個針對HER2基因的RNA干擾質(zhì)粒,并通過實時定量PCR技術(shù)和western blot方法篩選出了基因沉默效率最高的干擾質(zhì)粒HER2-shRNA2。前期的實驗只是對shRNA干擾HER2基因的直接效果進行測試,將HER2-shRNA2轉(zhuǎn)染入SKBR-3乳腺癌細胞中出現(xiàn)了HER2mRNA和HER2蛋白表達水平的下降。而HER2基因被抑制后,會產(chǎn)生一系列的生物學反應,其中對細胞增殖和凋亡的影響則是我們關(guān)心的焦點。

在本次實驗中我們首先對細胞增殖速度進行了定量測定,采用了直接計數(shù)法和MTT比色測定兩種方法。通過直接計數(shù)的方法,我們可以直觀的看到shRNA的細胞增殖速度明顯比陰性對照和空白對照組慢。而通過MTT比色測定法計算的生長抑制率和直接計數(shù)法繪制生長曲線的結(jié)果是一致的。進一步的流式細胞儀檢測中我們發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染HER2-shRNA2干擾質(zhì)粒組的SK-BR-3細胞大多會停留在G0/G1期,我們知道停留在G0/G1期的細胞會進一步走向凋亡的途徑[10],所以最終檢測結(jié)果中HER2-shRNA2質(zhì)粒干擾組的細胞凋亡率大大提高。增殖細胞核抗原（PCNA）是DNA聚合酶δ的輔助蛋白,它是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標。當細胞增殖旺盛時,細胞中的PCNA表達量會很;而當細胞增殖受到抑制的時候,PCNA的表達量也會一定程度的下降。本實驗對PCNA進行了western blot檢測,western blot的結(jié)果可知HER2-shRNA2干擾質(zhì)粒組的PCNA表達量下降,而在生長旺盛的陰性對照和空白對照組的細胞中PCNA的表達大大增強。PCNA的測定結(jié)果解釋了,為什么干擾質(zhì)粒組的細胞生長速度比較慢,而RNAi陰性對照和空白對照組腫瘤細胞生長速度較快。

HER2是一系列信號轉(zhuǎn)導途徑的起始分子,它會發(fā)動一系列的生物學反應促進腫瘤的生長。本研究結(jié)果顯示HER2-shRNA2干擾質(zhì)粒在細胞水平可以抑制HER2基因和HER2蛋白的表達,并促進乳腺癌細胞凋亡,最終控制乳腺癌細胞的增殖速度,可以做為活體動物水平抗腫瘤實驗的優(yōu)選載體,有望開發(fā)為新一代抗腫瘤基因藥物。

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