王葆春,宮曉光,呂云福

（海南省人民醫(yī)院普外科,海南?？?570311）

我們通過建立阻塞性黃疸（阻黃）大鼠肝纖維化模型,應(yīng)用水溶性殼聚糖治療,研究其對肝纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和分組 健康雄性SD大鼠72只,體重250-280 g,由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,隨機(jī)分成3組:（1）膽總管不結(jié)扎+生理鹽水組（SO組）;（2）膽總管結(jié)扎+生理鹽水組（BDL+NS組）;（3）膽總管結(jié)扎+水溶性殼聚糖組（BDL+WSC組）。每組術(shù)后再隨機(jī)分設(shè)7、14、21 d個(gè)3時(shí)相點(diǎn),每個(gè)時(shí)相點(diǎn)8只。

1.2 動(dòng)物模型制作 術(shù)后6 h,SO組、BDL+NS組行腹腔內(nèi)注射NS（2ml/kg體重,1次/d）;BDL+水溶性殼聚糖組腹腔內(nèi)注射WSC（600 mg/kg體重,1次/d）。分籠普通飼養(yǎng),自由進(jìn)水進(jìn)食。

1.3 檢測方法和觀察內(nèi)容 分別于術(shù)后7、14、21 d取材。（1）自動(dòng)生化分析儀測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TB）。（2）肝組織蘇木素-伊紅（HE）染色。（3）試劑盒檢測HSC內(nèi)MDA、SOD含量:按試劑盒說明書進(jìn)行操作測定。（4）用RT-PCR檢測 I、III型膠原。I型膠原PCR引物序列:Sence5-ACAGGCGAACAAGGTGACAGAG-3,Antisence5-GCCAGGAGAACCAGCAGAGC-3（158 bp）;

Ⅲ型膠原PCR引物序列:Sence5-AGATGCTGGTGCTGAGAAGAAAC-3;Antisence5-GCTGGAAAGAAGTC TGAGGAAGG-3（137 bp）

2 結(jié)果

2.1 肝功能測定結(jié)果 ALT、AST、TB值在膽管梗阻7、14 d時(shí)BDL+NS組比BDL+WSC組升高明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（7 d,P＜0.05;14 d,P＜0.05）,而21 d時(shí)兩組均明顯升高,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 光鏡觀察 膽管結(jié)扎7 d,肝細(xì)胞出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死和少量纖維組織增生;膽管結(jié)扎14 d時(shí)肝小葉內(nèi)可見多種形態(tài)的壞死灶,周圍炎性細(xì)胞浸潤,纖維組織及小膽管廣泛增生;膽管結(jié)扎21 d時(shí)肝組織增生更明顯,結(jié)構(gòu)紊亂呈肝硬化特征;BDL+WSC組在7、14 d時(shí)肝組織病理改變均較BDL+NS組輕;膽總管結(jié)扎+WSC組21 d時(shí)兩組改變基本相同。

2.3 HSC內(nèi)MDA測定結(jié)果 膽道梗阻后MDA顯著升高,隨著梗阻的遷延升高更明顯。WSC治療后,7、14 d時(shí)MDA顯著降低（7 d,P＜0.01;14 d,P＜0.05）,但21 d時(shí),與BDL+NS組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組和各時(shí)相段HSC內(nèi)MDA含量測定結(jié)果（±s±s,nmol/mg p rot）組別 n 7 d 14 d 21 d SO組 8 10.87±2.23 10.48±2.53 10.44±2.32 BDL+NS組 8 25.45±4.27 34.63±5.44 41.31±5.76 BDL+WSC組 8 18.54±3.95** 26.39±4.58* 39.68±5.19注:與BDL+NS組比較,**P＜0.01,*P＜0.05

2.4 HSC內(nèi)SOD測定結(jié)果 膽道梗阻后SOD顯著降低,隨著梗阻的遷延降低更明顯。WSC治療后,7、14 d時(shí)SOD顯著升高（7 d,P＜0.01;14 d,P＜0.05）,但21 d時(shí),與BDL+NS組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3-6 各組和各時(shí)相段HSC內(nèi)SOD含量測定結(jié)果（±s±s,nmol/mgprot）組別 n 7 d 14 d 21 d SO組 8 58.39±3.13 57.36±3.09 58.37±3.23 BDL+NS組 8 41.68±3.82 35.84±4.43 32.68±4.69 BDL+WSC組 8 47.22±3.49 42.75±5.08* 33.53±4.61注:與BDL+NS組比較,**.P＜0.01,*P＜0.05

2.5 用RT-PCR檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原和 TNF-αmRNA

SO組大鼠纖維化相關(guān)調(diào)控基因I、III型膠原、TNF-α的表達(dá)相對較低或不表達(dá);與SO組比較,BDL+NS組Ⅰ、Ⅲ型膠原、TNF-αmRNA表達(dá)水平明顯上升（P＜0.01）,與BDL+NS組比較,BDL+WSC組Ⅰ、Ⅲ型膠原、TNF-α表達(dá)水平明顯下降。

3 討論

21 d時(shí)大鼠肝臟Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)變化

多糖是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一,是重要的生物活性物質(zhì)。多糖作為一種天然的高分子化合物,與生命的各種生理機(jī)能密切相關(guān),產(chǎn)生多種多樣的生物學(xué)功能,如免疫調(diào)節(jié)、抗感染、抗腫瘤、抗凝血、降血糖和抗病毒等。目前,有關(guān)糖類在肝臟疾病中的研究已有不少報(bào)道,例如,Lee等[1]研究發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞表面的去唾液酸化糖蛋白受體及其甘露糖N-乙酰葡萄糖受體可以清除體內(nèi)異常的糖基化蛋白以維持血清糖蛋白的平衡。因此,可通過檢測血清中N-糖基化蛋白譜的異常分布來判斷肝細(xì)胞功能受損情況。還有研究[2-4]發(fā)現(xiàn),肝炎和肝癌患者血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白的糖鏈異常。在多糖保肝、護(hù)肝和抗纖維化方面,一些生物活性多糖,如云芝多糖和香菇多糖等的作用已得到公認(rèn)。

肝纖維化是肝病的共有病理改變,肝星狀細(xì)胞（HSC）在肝纖維化形成中膠原的過度合成時(shí)起著非常重要的作用,HSC的活化和增殖在纖維形成中起著關(guān)鍵作用。HSC的激活及其激活后ECM的異常表達(dá)是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。HSC在肝纖維化形成時(shí)膠原的過度合成中起著主要的作用[5],HSC的活化和增殖在纖維形成中起著關(guān)鍵作用,肝星狀細(xì)胞活化后可以合成大量細(xì)胞外基質(zhì)。TNF-α的大量釋放可參與肝臟的損傷和修復(fù)循環(huán),并最終引起肝臟大量ECM的合成與沉積,因此HSCs是肝臟中TNF-α的主要來源;TNF-α可進(jìn)一步激活HSC,Weiner等[5,6]研究發(fā)現(xiàn),TNF-α不僅可使體內(nèi)外培養(yǎng)的大鼠肝臟Ito細(xì)胞增加合成膠原蛋白和蛋白多糖約3.5和2.6倍,增加3T3 L1脂肪細(xì)胞系Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型前膠原mRNA的表達(dá),而且還能消除轉(zhuǎn)化生長因子β對大鼠Ito細(xì)胞增殖的抑制作用,促使Ito細(xì)胞增殖并分泌纖維連接蛋白和蛋白多糖等基質(zhì)。Czaja等[7]發(fā)現(xiàn),肝纖維化早期肝內(nèi)TNF-αmRNA首先出現(xiàn)并逐漸增高,隨后Ⅰ型膠原mRNA含量開始上升,至肝纖維化晚期,TNF-αmRNA水平逐漸下降,而Ⅰ型膠原mRNA水平持續(xù)升高,表明TNF-α在肝纖維化啟動(dòng)和發(fā)展過程中起重要作用。許多研究顯示肝纖維化時(shí)Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達(dá)水平是增加的[8]。通過體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抗氧化劑可以防止氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化和肝纖維化,提示氧化應(yīng)激可以直接或者間接對HSC表現(xiàn)出促纖維相關(guān)的刺激[9,10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,膽總管梗阻不同時(shí)期肝纖維化明顯異常,隨病程進(jìn)展,肝纖維化水平增強(qiáng)隨之加重。而肝纖維化是阻黃導(dǎo)致肝硬化的細(xì)胞病理機(jī)理之一[11]。用WSC治療后,大鼠HSC內(nèi)SOD的含量在7、14 d時(shí)明顯高于對照組（7 d,P＜0.01;14 d,P＜0.05）,而且使MDA含量降低（7 d,P＜0.01;14 d,P＜0.05）,肝臟功能明顯得到保護(hù)。與對照組比較,BDL+NS組 Ⅰ 、Ⅲ型膠原 、TNF-αmRNA 表達(dá)增加。與BDL+NS組相比,BDL+WSC組的Ⅰ、Ⅲ型膠原、TNF-αmRNA表達(dá)減少。因此說明WSC抑制了脂質(zhì)過氧化反應(yīng),從而減輕阻黃時(shí)肝損傷,其機(jī)制可能是WSC使氧自由基（如O2-和·OH）與線粒體膜的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)減少,減輕了脂質(zhì)過氧化物對線粒體膜完整性的破壞;減輕了氧自由基抑制線粒體的氧化磷酸化,使能量生成減少程度下降,從而減輕肝臟的纖維化。

另外,本實(shí)驗(yàn)中還可見用WSC治療至21 d后,BDL+NS組和BDL+WSC組中SOD都更進(jìn)一步減少,但兩組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示水溶性殼聚糖只在早、中期能夠通過減少自由基的產(chǎn)生,減輕脂質(zhì)過氧化損傷,,從而起到保護(hù)HSC,減輕肝臟損傷的作用,但晚期效果仍差,需要進(jìn)一步尋找能更有效的保護(hù)抗肝纖維化藥物。本研究開展了低聚殼聚糖在抗肝纖維化方面的作用研究,并探討了其作用機(jī)制,豐富了中藥多糖的抗肝纖維化作用,為尋找特異、有效的抗肝纖維化治療藥物奠定了基礎(chǔ)。

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