楊淑榮， 王延麗， 謝昌平， 李超萍， 張科立

（海南大學環(huán)境與植物保護學院，儋州 571737）

加那利海棗葉斑病病原鑒定＊

楊淑榮， 王延麗， 謝昌平＊＊， 李超萍， 張科立

（海南大學環(huán)境與植物保護學院，儋州 571737）

對加那利海棗葉斑病的癥狀進行了觀察。結果表明，加那利海棗葉斑病主要發(fā)生在葉片和葉柄。初期癥狀是在葉片和葉柄出現水漬狀褪綠色的褐色小點，病斑擴大成淺褐色橢圓形或不規(guī)則病斑，病斑周圍有黃色的暈圈，后期變褐色至灰褐色，中央產生小黑點。按照柯赫氏法則對該病害的病原菌進行分離和致病性測定。通過形態(tài)學觀察和rDNA-ITS序列分析鑒定，將病原菌鑒定為異色擬盤多毛孢［Pestalotiopsis versicolor（Speg.）Steyaert］。

加那利海棗； 葉斑病； 異色擬盤多毛孢； rDNA-ITS； 鑒定

＊ 致 謝： 在試驗過程中，廣西大學韋繼光教授對病原菌鑒定給予幫助，中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所黃貴修研究員、時濤助理研究員和劉先寶助理研究員在分子鑒定方面給予大力幫助，謹表衷心感謝！

＊＊ 通信作者 Tel：0898-23306796；E-mail：xiechangping002＠sina.com

加那利海棗（Phoenix canariensis）屬棕櫚科，刺葵屬，別名長葉刺葵、針葵和檳榔竹等。是一種極具熱帶風情的觀賞棕櫚植物，廣泛應用于公園造景和行道綠化，也可作室內觀賞，是世界著名的高級風景樹種之一［1－2］。近年來隨著城市綠化，加那利海棗的栽培數量逐漸增加。2006年7－10月，筆者在海南省儋州市南湖公園和中心花圃內的加那利海棗葉片和葉柄上發(fā)現一種病害，田間發(fā)病率高達85%～90%。目前，國內對加那利海棗葉斑病有關報道較少。羅金水等［3］報道福建省加那利海棗苗圃中發(fā)生的褐斑病是由柯氏帚梗柱孢霉（Cylindrocladium colhouniiPeerally）引起的。金亮等［4］報道廈門地區(qū)加那利海棗葉斑病由掌狀擬盤多毛孢（Pestalotiopsis palmarumCooke.）引起，但僅危害葉片，不危害葉柄，且病原菌的鑒定僅通過形態(tài)學鑒定。筆者通過形態(tài)學觀察發(fā)現，加那利海棗葉斑病菌與金亮等［4］的掌狀擬盤多毛孢有較大的差異。張家祥和葛起新等詳細報道在加那利海棗上分離出擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsisspp.）真菌，分別為異色擬盤多毛孢［P.versicolor（Speg.）Steyaert］和韋司梅擬盤多毛孢［P.vismiae（Petr.）Zhang et Xu Comb.nov.］，并對病原菌的孢子形態(tài)和大小及培養(yǎng)性狀作了描述［5－6］。為了明確引起加那利海棗葉斑病的病原，筆者對海南省儋州市加那利海棗葉斑病的病原菌進行了分離和鑒定。

1 材料和方法

1.1 材料來源

材料采自海南省儋州市南湖公園內的加那利海棗上發(fā)病典型的葉片和葉柄。

1.2 癥狀描述

按常規(guī)方法對田間病株出現的癥狀進行描述，并拍攝病害的癥狀。

1.3 菌株的分離與純化

采用常規(guī)組織分離方法［7］，從發(fā)病部位的病健交界處切取大小約4～5mm的組織塊，用70%乙醇消毒數秒后，用0.1%升汞表面消毒1min，無菌水沖洗3次，放置在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，觀察分離菌的生長和產孢情況，將葉片和葉柄上分離所得的病原菌分別標記為P1和P2菌株。采用瓊脂平板稀釋純化法進行純化［7］。

1.4 菌株的致病性測定

將純化、產孢的病原菌P1、P2菌株用無菌水配制成50～60個分生孢子（10×20倍）的孢子懸浮液，田間噴灑在同一品種健康寄主植株的葉片和葉柄上，以無菌水作為對照；接種后保濕，觀察并記錄發(fā)病情況。

1.5 病原菌形態(tài)觀察

將純化的菌株分別接種在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5d后，觀察菌落顏色、形狀、大小及產孢情況，后挑取病原菌，制臨時玻片，鏡檢并觀察分生孢子的顏色、形態(tài)和大小。

1.6 病原菌核糖體DNA-ITS序列的PCR擴增和分析

1.6.1 基因組DNA的提取

采用 CTAB提取總 DNA［8］。

1.6.2 病原菌核糖體DNA-ITS序列擴增

（1）通用引物：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。由上海英駿生物技術有限公司合成。

（2）PCR反應體系：ddH2O 19μL；10×Buffer 2.5μL；dNTP（2.5mmol／L）0.7μL；ITS1（10pmol／L）1μL；ITS4（10pmol／L）1μL；TaqDNA聚合酶（2.5U／μL）0.3μL；模板 DNA（0.5ng／μL）0.5μL?？傮w積25μL。PCR反應參數為：94℃預變性3min；94℃變性50s；60℃退火1min；72℃延伸1min；35個循環(huán)；72℃延伸完全10min。反應完成后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6.3 病原菌核糖體DNA-ITS序列同源性比較

對測得的供試菌株核糖體DNA-ITS區(qū)段的序列，分別運用GenBank核酸數據庫中的BLAST工具軟件，在DNA序列數據庫中搜索同源DNA序列并進行比較分析，根據BLAST搜索和比較的結果，進行同源性分析。

2 結果與分析

2.1 癥狀

葉斑病主要危害葉片和葉柄。發(fā)病初期在葉片上出現水漬狀褪綠色的褐色小點，病斑擴展成淺褐色橢圓形或不規(guī)則形小斑，病斑大小為1～3mm，病斑周圍有黃色的暈圈；隨病斑的進一步擴大，病斑周圍出現輪紋，多個病斑愈合成不規(guī)則形的大斑，病斑中央呈黑褐色，邊緣顏色成深褐色，在病斑中央散生許多小黑點，發(fā)病嚴重時整葉干枯（圖1a）。

葉柄上發(fā)病多從帶刺部位先發(fā)病，初期在植株葉柄上出現水漬的褐色小斑點，中期小斑點變?yōu)榧t褐色至黑褐色長條形病斑，并且不斷地擴大，后期幾個病斑擴大連成一片，形成大病斑，病部表皮皺縮，中央凹陷，嚴重時造成整個葉柄干枯（圖1b）。

2.2 病原菌的致病性

接種15d后，用孢子懸浮液接種的葉片和葉柄均發(fā)病，所產生的癥狀與田間自然發(fā)病的癥狀相同，并從接種發(fā)病的病斑上重新分離到相同的病原菌。而對照葉片和葉柄均不發(fā)?。▓D1c）。

2.3 病原菌的形態(tài)

該病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，菌落圓形，邊緣不平滑，菌絲白色絮狀，孢子堆顏色呈墨汁色，排列比較稀疏，菌絲層分布均勻，無輪紋；背面具淡橘黃色的色素；在28℃的光照條件下有分布不均勻的黑色斑點，無明顯輪紋，10d后在菌落表明產生黑色的分生孢子堆（圖1d）。分生孢子長梭形，有的稍微彎曲，4隔5胞，分生孢子大小為：（21.1～32.0）（27.0）μm×（6.5～11.2）（8.6）μm；中間3個細胞著色，上二色孢褐色至暗褐色，第三色胞顏色較淺，淡褐色，分隔處顏色加深；色胞長（13.8～19.5）（16.9）μm；頂和尾孢均為三角形，無色透明，頂胞上著生無色附屬絲2～3根，長（10.4～26.0）（16.2）μm，尾孢上著生一根基部附屬絲，中生，長（3.9～9.1）（5.2）μm（圖1e）。分生孢子從第3個有色胞萌發(fā)，首先第三色胞膨大變圓形，顏色變淺，后從其一邊或兩邊同時萌發(fā)出芽管，芽管慢慢伸長變成根狀的細管，隨著芽管的伸長第三色胞逐漸收縮，整個細胞也會漸漸收縮（圖1f）。根據形態(tài)特點，查閱相關資料［5－6，9－10］初步 確定該 病 原 菌 為 有 絲 分 裂 孢 子 真 菌的腔孢綱（Coelomycetes）、黑盤孢目（Melanconia-les）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）、異色擬盤多毛孢［P.versicolor（Speg.）Steyaert］。

2.4 病原菌的rDNA-ITS分子鑒定

將擴增片段經克隆和測序的rDNA-ITS序列在NCBI進行BLAST比對，結果顯示：病原菌目的片段序列與數據庫中已有的異色擬盤多毛孢（P.versicolor）rDNA-ITS核苷酸序列（登錄號為AF405298）相似性達99%。結合形態(tài)學特征和rDNA-ITS序列對比分析，確定引起加那利海棗葉斑病的病原菌為異色擬盤多毛孢菌［P.versicolor（Speg.）Stey.］。

3 討論

對擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）種的鑒定，傳統(tǒng)的方法是采用寄主范圍、培養(yǎng)性狀和病原菌的形態(tài)學進行。由于擬盤多毛孢菌的寄主范圍非常廣，因此，根據寄主范圍來確定種是不準確的。培養(yǎng)性狀在不同轉代間穩(wěn)定性較差，但屬內不同種之間差異確實存在，菌落形態(tài)顏色、菌落背面色素沉淀情況、背面輪紋的有無等在種間鑒定方面具有一定的參考價值。而病原菌形態(tài)學在鑒定中極為重要，特別是分生孢子頂端附屬絲的端部是否匙狀膨大是重要的形態(tài)特征，它能夠較穩(wěn)定地遺傳，并且在光學顯微鏡下比較明顯，因此，對該菌種鑒定有較大的參考作用。但對于多數擬盤多毛孢菌由于沒有匙狀膨大這一重要形態(tài)特征，并且各菌種間差異往往不明顯，所以僅憑形態(tài)學有時也難以確定種。由于rDNA-ITS區(qū)域種間存在著豐富的變異，而在種內不同菌株間卻具高度保守性，常用于鑒定種和種內新株系［11－12］。本研究結合病原菌培養(yǎng)性狀、形態(tài)學特征和rDNA-ITS序列分析，確定加那利海棗葉斑病菌為異色擬盤多毛孢菌［P.versicolor（Speg.）Steyaert］。

［1］ 劉海桑.觀賞棕櫚［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2002：276.

［2］ 林有潤.觀賞棕櫚［M］.哈爾濱：黑龍江科學技術出版社，2003：59.

［3］ 羅金水，王美盛，林秀香，等.加那利海棗褐斑病的病原菌鑒定［J］.熱帶作物學報，2009，30（1）：104-107.

［4］ 金亮，丁印龍.廈門地區(qū)主要棕櫚植物病害種類普查鑒定及其防治［J］.熱帶農業(yè)科學，2000，86（4）：12-19.

［5］ 張家祥.中國南方擬盤多毛孢屬真菌及其分種性狀的研究［D］.杭州：浙江大學，2002：29-30.

［6］ 葛起新，陳育新，徐同.中國真菌志（第三十八卷：擬盤多毛孢屬）［M］.北京：科學出版社，2009：195-198.

［7］ 方中達.植病研究方法［M］.第3版.北京：中國農業(yè)出版社，1998：137-138，195-198.

［8］ 陳德富，陳喜文.現代分子生物學實驗原理與技術［M］.第1版.北京：科學出版社，2006：100.

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［10］韋繼光，徐同，郭良棟，等.根據形態(tài)學和分子系統(tǒng)學特征界定擬盤多毛孢屬的種［J］.廣西農業(yè)生物科學，2005，24（3）：311.

［11］張志華，洪葵.核酸序列直接分析在菌物鑒定方面的應用［J］.華南熱帶農業(yè)大學學報，2006，12（2）：39.

［12］劉春來，文景芝，楊明秀.rDNA-ITS在植物病原菌物分子檢測中的應用［J］.東北農業(yè)大學學報，2007，38（1）：101.

Identification of the pathogen causing the leaf spot disease ofPhoenixcanariensis

Yang Shurong， Wang Yanli， Xie Changping， Li Chaoping， Zhang Keli
（1.College of Environmental and Plant Protection，Hainan University，Danzhou571737，China）

The symptoms of leaf spot ofPhoenix canariensiswere observed.The results showed that leaf spot ofP.canariensismainly occurred on leaves and petioles.The early symptom was brown lesion with water soaked and chlorotic leaves and petioles.Lesion expanded into brownish oval or irregular spots.The spots were surrounded by yellow helos and the spots changed into brown to grayish brown during the late stage.Centres of the spots produced black dots.According to Koch’postulates，the pathogens were isolated and pathogenicity was determined.Based on morphological characters and sequence of rDNA-ITS，the pathogen was identified asPestalotiopsis versicolor（Speg.）Steyaert.

Phoenix canariensis； leaf spot；Pestalotiopsis versicolor； rDNA-ITS； identification

S 436.8

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2011.05.027

2010-09-28

2010-12-02

海南省科技基金項目（No.Rnd0524）