黃小瓊，劉盛來，鄭佳林，黃虹坤，黃小紅，饒子亮，鐘志勇，唐小江

（廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，佛山 528248）

微生態(tài)研究表明，腸道微生物是人類健康和疾病的重要決定因素。乳桿菌和雙歧桿菌為腸道益生菌，能調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，參與營養(yǎng)物質(zhì)代謝，構(gòu)建免疫防御系統(tǒng)，對(duì)保證人體健康，預(yù)防疾病具有重要作用。腸道內(nèi)由于這些有益菌的存在，使碳水化合物分解產(chǎn)生多種有機(jī)酸，而且不產(chǎn)生任何有毒的代謝產(chǎn)物，因此提高了機(jī)體的消化機(jī)能，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，并且競(jìng)爭(zhēng)性地抑制某些入侵的病原菌或抑制腸道內(nèi)有害菌的增殖［1］。因此，保持腸道有益菌群的數(shù)量是宿主保持健康的關(guān)鍵因素。合生元益生菌沖劑（兒童型）由嗜酸乳桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、低聚果糖、麥芽糊精、香蘭素等組成的保健食品，具有免疫調(diào)節(jié)的保健功能。該品是上市多年的保健品，為臨床使用和調(diào)節(jié)腸道菌群相關(guān)方面實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步提供安全有效的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，筆者對(duì)合生元益生菌沖劑調(diào)節(jié)腸道菌群作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物來源：

選用健康的SPF級(jí)BALB/C小鼠20只，雄性，體重18～22g。由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：0085698。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2008-0002，經(jīng)過中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及檢測(cè)試劑盒

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器：

BS-3000A電子天平，上海友聲衡器有限公司生產(chǎn)，感量0.1g。智能生化培養(yǎng)箱：型號(hào)：PHX-250，生產(chǎn)廠家：寧波萊?？萍加邢薰尽Ｈ詣?dòng)滅菌器：型號(hào)：LMQ.C，廠家：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。電子分析天平：型號(hào)：JJ1000，廠家：常熟市雙杰測(cè)試儀器長(zhǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)藥物及檢測(cè)試劑：

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物：法國合生元益生菌沖劑（兒童型）：合生元（廣州）健康產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：1.5g/袋，批號(hào)：1001038。

1.2.2.2 主要檢測(cè)試劑：伊紅美籃瓊脂：批號(hào)：1012105，廠家：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。，疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂：批號(hào)：1003251，廠家：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。，BBL瓊脂：批號(hào)：100315，廠家：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。，Lbs瓊脂：批號(hào)：100929，廠家：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。，TSC瓊脂：批號(hào)：1009032，廠家：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。麥?zhǔn)媳葷峁埽号?hào)：10000198490，廠家：法國biomerieux.sa，API50CHl培養(yǎng)基：批號(hào)：863703301，廠家：法國biomerieux.sa，碳水化合物鑒定試劑條API50CH：批號(hào)：866264101，廠家：法國biomerieux.sa。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法［2］

1.2.3.1 動(dòng)物分組和給藥方法：

將檢疫合格的小鼠20只隨機(jī)分為合生元益生菌沖劑組和陰性對(duì)照組，每組10只。合生元益生菌沖劑組小鼠每天給予1g/kg·d合生元益生菌沖劑1次/d，連續(xù)給予14d，陰性對(duì)照組給予生理鹽水，各組動(dòng)物每天按20mL/kg體重灌胃給藥。

1.2.3.2 小鼠腸道菌群的檢測(cè)

給予樣品之前，提起小鼠尾巴無菌環(huán)境下收集新鮮糞便0.1g，裝于事先滅菌的帶玻璃珠EP管中，加生理鹽水0.9mL，此為稀釋度10-1，立即將EP管封口。于振蕩器上振蕩5min，使糞便均質(zhì)化。將上述振蕩好的標(biāo)本進(jìn)行10倍系列稀釋至10-5。選用10-1、10-2、10-3、10-5，用1mL注射器和滅菌吸頭，自高稀釋度向低稀釋度在相應(yīng)的培養(yǎng)基上各滴加稀釋液50μL，待接種好的培養(yǎng)基吸干后，腸桿菌：伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，37℃24h需氧培養(yǎng)；產(chǎn)氣莢膜梭菌：TSC培養(yǎng)基，37℃48h厭氧培養(yǎng)；腸球菌：疊氮鈉結(jié)晶紫七葉苷培養(yǎng)基，37℃48h需氧培養(yǎng)；乳桿菌：LBS培養(yǎng)基，37℃48h培養(yǎng)；雙歧桿菌：BBL培養(yǎng)基，37℃48h厭氧培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，以菌落形態(tài)、革蘭染色、生化反應(yīng)鑒定所需目的菌。培養(yǎng)好的細(xì)菌經(jīng)鑒定后計(jì)算每克糞便中細(xì)菌數(shù)量（CFU·g-1）。選擇菌落適中的稀釋度，算出同一稀釋度平均菌落數(shù)（X）。公式：CFU·g-1標(biāo)本=X/0.05×稀釋倍數(shù)×1/標(biāo)本質(zhì)量（g）。結(jié)果用常用對(duì)數(shù)值lgCFU·g-1表示。最后一次給予合生元益生菌沖劑之后24h，與實(shí)驗(yàn)前同樣方法取直腸糞便，檢測(cè)腸道菌群，方法同上。

2 統(tǒng)計(jì)方法

體重采用SPSS16.0軟件進(jìn)行重復(fù)資料方差分析（P＞0.05），菌群數(shù)量采用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)

陰性對(duì)照組、合生元益生菌沖劑組在給藥期間均正常增長(zhǎng)、精神狀態(tài)等未見異常。

3.2 體重

合生元益生菌沖劑組小鼠的體重在給藥第7天與陰性對(duì)照組比較均有顯著性差異（P＜0.05），在給藥第14天與陰性對(duì)照組比較無顯著性差異（P＞0.05），詳見表1及圖1。

表1 合生元益生菌沖劑對(duì)小鼠體重結(jié)果的影響（g，±s）Tab.1 Effect of BIOSTIME probiotics on body weight of mice（g，±s）

表1 合生元益生菌沖劑對(duì)小鼠體重結(jié)果的影響（g，±s）Tab.1 Effect of BIOSTIME probiotics on body weight of mice（g，±s）

注：“*”表示用藥組與陰性對(duì)照組比較有顯著性差異P＜0.05Note：compared with control group，“*”P＜0.05

組別Groups 動(dòng)物數(shù)Number 測(cè)定時(shí)間Test time D0 First day D7 7 days D14 14 days陰性對(duì)照組Normal control group 10 20.6±1.0 22.1±1.5 25.0±0.9合生元益生菌沖劑組BIOSTIME probiotics group 10 20.4±0.8 23.1±0.6*24.4±0.8

圖1 合生元益生菌沖劑對(duì)小鼠體重結(jié)果的影響Fig.1 Effect of BIOSTIME probiotics on body weight of mice

3.3 小鼠糞便腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌5種菌群數(shù)量的檢查

合生元益生菌沖劑組與陰性對(duì)照組比較腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌5種菌群數(shù)量均無顯著性變化（P＞0.05），合生元益生菌沖劑組灌胃前后自身比較雙歧桿菌數(shù)量有顯著性增加（P＜0.05），合生元益生菌沖劑組灌胃前后自身比較腸桿菌、腸球菌、乳桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量有無顯著性變化（P＞0.05）。詳見表2。

表2 合生元益生菌沖劑對(duì)小鼠腸道菌群數(shù)量的影響（log±s）Tab.2 Effect of BIOSTIME probiotics on intestinal flora of mice（log±s）

表2 合生元益生菌沖劑對(duì)小鼠腸道菌群數(shù)量的影響（log±s）Tab.2 Effect of BIOSTIME probiotics on intestinal flora of mice（log±s）

注：“Δ”表示用藥組灌胃前后自身比較有顯著性差異P＜0.05Note：compared with gavage before and after the group，“Δ”P＜0.05

檢測(cè)項(xiàng)目Test處理Process陰性對(duì)照組normal control group合生元益生菌沖劑組BIOSTIME probiotics group腸桿菌E.coli 灌胃前Data before feeding 7.13±0.27 7.15±0.35灌胃后Data after feeding 6.71±0.81 6.71±0.64腸球菌Enterococcus 灌胃前Data before feeding 7.42±0.24 7.45±0.16灌胃后Data after feeding 6.91±1.00 7.10±0.57產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium perfringens 灌胃前Data Before feeding 6.23±0.10 6.25±0.14灌胃后Data after feeding 5.88±0.86 5.80±0.86乳桿菌Lactobacillus 灌胃前Data Before feeding 7.36±0.18 7.40±0.22灌胃后Data after feeding 6.98±0.60 7.04±0.61雙歧桿菌Bifidobacterium 灌胃前Data Before feeding 9.33±0.09 9.24±0.14灌胃后Data after feeding 9.36±0.49 9.64±0.46Δ

3.4 腸桿菌、腸球菌和雙歧桿菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)結(jié)果

腸桿菌在EMB培養(yǎng)基上長(zhǎng)出黑紫色凸起菌落，有金屬光澤腸球菌在疊氮鈉結(jié)晶紫七葉苷培養(yǎng)基上長(zhǎng)出有明顯褐色圈菌落，雙歧桿菌在BBS培養(yǎng)基上長(zhǎng)出淡黃色凸起濕潤的小菌落。見彩插2（圖2）

3.5 API50CHl乳桿菌的碳水化合物鑒定結(jié)果

49項(xiàng)API50CHl乳桿菌的碳水化合物鑒定結(jié)果，均符合國標(biāo)GB/T4789 35-2010有關(guān)乳桿菌的生化特性。見彩插2（圖3）

4 討論

人體體表、體腔內(nèi)存在大量并不致病的微生物群，這些微生物群對(duì)其宿主非但無害，而且有益，并有眾多的生理效應(yīng)。若是內(nèi)外環(huán)境發(fā)生重大變化時(shí)，致病微生物群與非致病微生物群之間的平衡就要遭到破壞，發(fā)生微生態(tài)失調(diào)，并引起宿主各種類型的疾病。人體微生態(tài)系統(tǒng)包括口腔、皮膚、泌尿、胃腸道四個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)，以腸道微生態(tài)系統(tǒng)最為主要、復(fù)雜。人體消化道正常菌群包括乳酸桿菌屬、腸道球菌、腸桿菌和擬桿菌屬等［3］。雙歧桿菌、乳桿菌是人腸道中有益菌的代表，主要通過降低腸道PH值、抑制韋永氏球菌、梭菌等腐敗菌增殖，減少腐敗物產(chǎn)生，，同時(shí)也因PH下降對(duì)病原菌的生存、增殖很不利［4］。

現(xiàn)有微生態(tài)制劑主要有益生菌、益生元和合生素［4］。利用有益活菌制劑以及增殖促進(jìn)制劑，保證或調(diào)整有益的腸道菌群構(gòu)成，從而收到特定的健康利益是當(dāng)前國內(nèi)外保健食品開發(fā)有效的、重要的領(lǐng)域。合生元益生菌沖劑是由嗜酸乳桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌等有益活菌制劑和低聚果糖、麥芽糊精等有益菌增殖促進(jìn)劑綜合研制而成。本實(shí)驗(yàn)研究表明，合生元益生菌沖劑（兒童型）可以增加小鼠體重、明顯促進(jìn)腸道益生菌雙歧桿菌的增殖，進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)感染的抵抗力。現(xiàn)如今，抗生素在抗感染中的廣泛應(yīng)用是導(dǎo)致機(jī)體腸道正常菌群失衡的最重要原因之一。腸道菌群失調(diào)的病因除了原發(fā)于腸道的疾病和全身性疾病以外，還包括抗生素應(yīng)用不合理、化療和免疫功能低下等。我們通過使用一定量的法國合生元益生菌沖劑，調(diào)整機(jī)體的免疫功能和營養(yǎng)狀態(tài)，促進(jìn)有益菌的增殖，證明了法國合生元益生菌沖劑對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。以上研究結(jié)果為臨床使用合生元益生菌沖劑和相關(guān)方面實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步提供安全有效的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。但是，合生元益生菌沖劑對(duì)腸道微生物的定植抗力如何尚需進(jìn)一步研究。

［1］徐永杰，張 波，張祎騰，牛蒡多糖的提取及對(duì)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用［J］，食品科學(xué)營養(yǎng)衛(wèi)生，2009，30（23）：428-431.

［2］中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003年版）［S］.

［3］陳 琛，江振友，宋克玉，等.中草藥對(duì)小鼠腸道菌群影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2011，23（1）：15-17

［4］鐘耀廣主編，功能性食品［M］，化學(xué)工業(yè)出版社，2004，（1）