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        甘丙肽重構(gòu)基因GAL(intronII)的克隆及其過表達轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建

        2011-02-16 14:55:02雷小春劉田福司蘇晉薛亮亮張引紅
        中國比較醫(yī)學雜志 2011年1期
        關鍵詞:內(nèi)含子堿基外顯子

        雷小春,劉田福,司蘇晉,薛亮亮,張引紅

        (山西醫(yī)科大學實驗動物中心,太原 030001)

        甘丙肽(galanin,GAL)是Tatemoto等于1983年從豬小腸提取出的由29個氨基酸(人類的GAL由30個氨基酸組成)組成的羧基末端酰胺化的肽類物質(zhì),GAL廣泛分布在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng),在下丘腦、海馬、杏仁核、中縫背核、前腦基底皮層、室下帶、嗅球以及脊髓背根神經(jīng)節(jié)等區(qū)域都可檢測到GAL及其受體的表達[1]。在正常生理過程GAL表達水平比較低而穩(wěn)定,但是在一些病理過程中GAL表達會有異常的變化[2]。近年研究還發(fā)現(xiàn)GAL與阿爾茨海默病、癲癇,高泌乳血癥、抑郁、神經(jīng)痛等的發(fā)病機制相關,同時也與攝食、學習和記憶等功能相關[3-6]。當前對于GAL轉(zhuǎn)基因模型的研究熱點主要集中于GAL缺失表達或者過表達模型中某些疾病相關的生理、病理特征,定位GAL在這些生理、病理過程中的作用,而在這些研究數(shù)據(jù)的取得大多數(shù)是建立在GAL轉(zhuǎn)基因模型的基礎上的[7-9]。

        為了研究人PDGF-β啟動子調(diào)控下GAL的表達,構(gòu)建GAL過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,對GAL各項功能進行研究,我們構(gòu)建了能夠在小鼠體神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛過量表達的GAL轉(zhuǎn)基因載體,為下一步進行顯微注射做好準備。

        1 材料和方法

        1.1 實驗材料

        1.1.1 實驗動物:C57BL/6小鼠由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供[SCXK(晉)2009-0001]。

        1.1.2 菌株和質(zhì)粒:含人血小板源性生長因子啟動子片段的psisCAT6α質(zhì)粒由中國協(xié)和醫(yī)科大學實驗動物中心秦川教授惠贈。大腸桿菌DH5a,質(zhì)粒pMD-19simple,pUC18均購自寶生物工程(大連)有限公司。

        1.1.3 試劑:RNAiso Reagent,DNA Fragment Purification Kit,DNA A-TailingKit,DNA WideRangeDNA Marker(100-6000)購自寶生物工程(大連)有限公司;Phusion超保真聚合酶,SalI,PstI,XbaI,HindIII限制性內(nèi)切酶購自NEB公司;AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購自Promega公司;QIAquick Gel Extraction kit購自Qiagen公司,Plasmid Mini Kit購自Omega公司;X-Gal、IPTG、Amp購自Amresco公司。

        1.1.4 主要引物:RT-PCR、常規(guī)PCR引物均參照GenBank中GAL基因和cDNA的標準序列,使用PrimerPremier5.0,Oligo6.72軟件進行設計。重疊延伸PCR引物根據(jù)理論上得出的重疊產(chǎn)物重新設計:正向引物F5′AAGGCGCCGGCGATATCCGGCCTGGT CGACTGCCACGGACACGTAGAG 3′,下劃線序列為SalI限制性酶切位點;反向引物R5′AACGTTTA CGAACCTGCAGCGATACGCTGCAGCATAGACG3′,下劃線序列為PstI限制性酶切位點。由北京奧科生物技術有限責任公司合成。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 C57BL/6小鼠總RNA、基因組DNA的提?。禾幩佬∈?,取新鮮腦組織,用RNAiso試劑和DNA提取試劑盒分別提取C57BL/6小鼠總RNA和基因組DNA,用紫外可見分光光度計檢測定RNA的濃度為1.47μg/μL,純度為1.98;DNA的濃度為0.33μg/μL,純度為1.78。

        1.2.2 擴增GAL全長cDNA:RT-PCR擴增GAL cDNA的編碼部分的片段,常規(guī)PCR擴增GAL cDNA5′和3′部分非編碼序列片段及GAL第二內(nèi)含子,以GAL cDNA的編碼部分和5′、3′部分非編碼序列片段通過重疊延伸PCR的方法獲得GAL的cDNA全長片段(包括編碼部分、5′端和3′端部分非編碼片段),分別用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并測序。

        1.2.3 在GAL全長cDNA中插入第二內(nèi)含子構(gòu)建重構(gòu)分子GAL(intronII):常規(guī)PCR:GAL第二內(nèi)含子需要插入的位點在GAL全長cDNA第三外顯子的第15個堿基處,以插入位點兩側(cè)的25個堿基加上第二內(nèi)含子兩端的25個堿基共50個堿基分別作為引物,與擴增GAL全長cDNA的引物分別配對,組成兩組引物將插入位點兩端的片段擴增出來,即將GAL全長cDNA切成了兩部分。1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,測序。

        隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展,促使了其對于蝦、蟹等沉性飼料持續(xù)增長的需求。面對競爭日趨激烈的市場,水產(chǎn)飼料生產(chǎn)以及水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)對于沉性水產(chǎn)飼料的品質(zhì)要求愈發(fā)提高:飼料外觀、水中穩(wěn)定性、吸水透心性、飼喂效果以及飼料轉(zhuǎn)化率等等,都成為評價沉性水產(chǎn)飼料品質(zhì)優(yōu)劣的標準。面對以上問題,牧羊有限公司在長期的實驗研發(fā)以及實踐生產(chǎn)過程中,對影響沉性水產(chǎn)飼料品質(zhì)的部分因素進行了一些總結(jié)和分析。

        重疊PCR:將上述步驟獲得的GAL全長cDNA的兩部分以及GAL第二內(nèi)含子PCR產(chǎn)物等摩爾比混合作為重疊PCR的模板,延伸5個循環(huán),加入引物。擴增條件:98℃預變性1min,98℃、5s,68℃、15s,72℃、50s,共25個循環(huán),72℃延伸10min,擴增出重構(gòu)基因GAL(intronII)。1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,測序。

        1.2.4 重組質(zhì)粒pMD19-T Simple/GAL(intronII)的構(gòu)建:膠回收GAL(intronII)片段PCR產(chǎn)物,進行加A反應,與pMD19-T Simple載體片段以摩爾比為3:1的比例混合,加入等體積solution I,16℃進行連接反應16h。以pMD19-T Simple載體自我連接作為陰性對照。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞,同時轉(zhuǎn)化陽性對照pUC18質(zhì)粒和陰性對照pMD19-T Simple載體自我連接反應液。取150μL轉(zhuǎn)化菌液涂于含氨芐青霉素(100mg/L)、IPTG(20mg/mL)和X-Gal(20mg/mL)的LB平板上,37℃孵育16h,隨機挑10個白色單菌落擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒,經(jīng)SalI、PstI分步酶切篩選陽性克隆。將含插入GAL(intronII)片段的質(zhì)粒測序。

        1.2.5 重組載體pUC18/PDGF-β-promoter的構(gòu)建:將psisCAT6α轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中DH5a感受態(tài)細胞,37℃平板培養(yǎng)16h。隨機挑取菌落接種在加有氨芐青霉素(100mg/mL)的5mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃,225r/min振蕩培養(yǎng)過夜。收集菌體提取質(zhì)粒,電泳進行初步鑒定。鑒定后取適量psisCAT6a質(zhì)粒溶液和pUC18質(zhì)粒溶液用限制性核酸內(nèi)切酶SalI,XbaI于37℃酶切3h。膠回收純化PDGF-β啟動子片段和線性pUC18,用Quantity One分析軟件進行定量。將PDGF-β啟動子片段和線性pUC18按3:1的比例16℃進行連接反應16h。以線性pUC18的自我連接作為陰性對照。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,同時轉(zhuǎn)化陽性對照pUC18質(zhì)粒和陰性對照線性pUC18自我連接反應液。取150μL轉(zhuǎn)化菌涂于含氨芐青霉素(100mg/L)、IPTG(20mg/mL)和X-Gal(20mg/mL)的LB平板上,37℃孵育16h。隨機挑10個白色單菌落擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒,經(jīng)XbaI和SalI雙酶切篩選陽性克隆。將含PDGF啟動子插入片段的質(zhì)粒測序。

        1.2.6 重組載體pUC18/PDGF-β-promoter/GAL(intronII)的構(gòu)建:取適量的pUC18/PDGF-βpromoter質(zhì)粒和pMD19-TSimple/GAL(intronII)質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶SalI,PstI于37℃酶切3h,膠回收純化GAL(intronII)片段和線型pUC18/PDGF-β-promoter,用Quantity One分析軟件進行定量。將GAL(intronII)片段與線型pUC18/PDGF-β-promoter按3:1的比例16℃進行連接反應16h。以線型pUC18/PDGF-β-promoter的自我連接作為陰性對照。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,同時轉(zhuǎn)化陽性對照pUC18質(zhì)粒和陰性對照線性pUC18/PDGF-β-promoter自我連接反應液。取150μL轉(zhuǎn)化菌涂于含氨芐青霉素(100mg/L)、IPTG(20mg/mL)和X-Gal(20mg/mL)的LB平板上,37℃孵育16h。隨機挑取白色菌落擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒,經(jīng)XbaI和HindⅢ雙酶切篩選陽性克隆。將含轉(zhuǎn)基因片段PDGF-β-promoter/GAL(intronII)的質(zhì)粒測序。

        所有測序中美泰和生物技術(北京)有限公司完成,使用Clustalw軟件對測序結(jié)果進行分析。

        2 結(jié)果

        2.1 GAL全長cDNA構(gòu)建結(jié)果鑒定

        由RT-PCR、常規(guī)PCR、重疊延伸PCR擴增得到了GAL的全長cDNA片段,序列長度為810bp,包括完整的cDNA序列699bp和兩端的酶切位點(分別為55bp和56bp)。電泳鑒定PCR產(chǎn)物與所需擴增的目的片段長度相符(圖1),測序結(jié)果與GenBank中標準序列比對,相似性達99%。

        圖1 GAL全長cDNA的PCR結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of GAL full-length cDNA PCR products

        2.2 重構(gòu)分子GAL(intronII)構(gòu)建結(jié)果的鑒定

        重構(gòu)分子是GAL全長cDNA分成的兩部分以及第二內(nèi)含子為模板重疊延伸出來的,長度為1436bp(圖2)。測序結(jié)果表明重疊延伸得到片段由GAL全長cDNA和第二內(nèi)含子組成,第二內(nèi)含子插入的位置準確,無突變和移碼。

        2.3 重組質(zhì)粒pMD19-T Simple/GAL(intronII)的鑒定

        pMD19-T Simple/GAL(intronII)用SalI、PstI分步酶切,在電泳圖中泳道1為酶切產(chǎn)物2.7kb和1.4kb的條帶,其中2.7kp的條帶即為pMD19-T Simple載體長度為2692bp,1.4kb的條帶為GAL(intronII)長度1436bp。泳道2為沒有酶切的pMD19-T Simple/GAL(intronII)(圖3)。測序證明酶切得到的條帶即為pMD19-T Simple載體和重構(gòu)分子GAL(intronII)。

        圖2 重構(gòu)分子GAL(intronII)的PCR結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of GAL(intronII)PCR products

        圖3 質(zhì)粒pMD19-T Simple/GAL(intronII)酶切鑒定Fig.3 Electrophoresis of enzyme digestion of plasmid pMD19-T Simple/GAL(intronII)

        2.4 重組質(zhì)粒pUC18/PDGF-β-promoter的鑒定

        以XbaI和SalI雙酶切重組質(zhì)粒pUC18/PDGF-β-promoter,在電泳圖中泳道1為酶切產(chǎn)物2.7kb和1.5kb的條帶,其中2.7kb的條帶為PUC18載體長度為2686bp,1.5kb的條帶為PDGF-β啟動子片段長度為1486bp。測序結(jié)果證明酶切得到的條帶即為PDGF-β啟動子片段(圖4)。測序結(jié)果與Gene Bank中標準序列比對,相似性達100%。

        圖4 質(zhì)粒PUC18/PDGF-β-promoter酶切鑒定Fig.4 Electrophoresis of enzyme digestion of the recombined plasmid PUC18/PDGF-β-promoter

        2.5 重組載體pUC18/PDGF-β-promoter/GAL(intronII)的鑒定

        以XbaI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒pUC18/PDGF-β-promoter/GAL(intronII),在電泳圖泳道1為酶切產(chǎn)物2.7kb和3.0.kb的條帶,其中2.7kb的條帶為PUC18載體長度為2686bp,3.0kb的條帶為1486bp dePDGF-β啟動子和1436bp的GAL(intronII)片段連接而得到的轉(zhuǎn)基因片段(圖5)。測序結(jié)果與理論上的重組片段進行比對,相似性達到99%。

        圖5 質(zhì)粒PUC18/PDGF-β-promoter/GAL(intronII)酶切鑒定Fig.5 Electrophoresis of enzyme digestion of the recombined plasmid PUC18/PDGF-βpromoter/GAL(intronII)

        3 討論

        本實驗參照了Holmberg和Kuteeva等的方法,在GAL全長cDNA插入第二內(nèi)含子,但是插入的位點不同[6]。根據(jù)Barbara等發(fā)表的研究,GAL cDNA的第一外顯子是非編碼序列,第二外顯子編碼了27個堿基的前導序列,第三外顯子的前15個堿基編碼了信號序列。第三外顯子的后39堿基和第四、五,六外顯子編碼了GAL和GAL相關肽(GMAP),第六外顯子的后150個堿基為非編碼序列[10]。本研究中嘗試運用重疊延伸PCR方法擴增的嵌入第二內(nèi)含子的GAL全長cDNA的是一種嵌合分子,自然不存在,但是并沒有打亂其基因表達框。早在上世紀80年代Rochester等在進行轉(zhuǎn)基因植物和動物的研究中已經(jīng)開始在cDNA中插入一段內(nèi)含子以增強其表達。試驗表明異源內(nèi)含子(特別是第一、二內(nèi)含子)可提高外源基因(特別是以cDNA為表達構(gòu)件)的表達效率[11,12]。Palmiter等進行的轉(zhuǎn)基因試驗了發(fā)現(xiàn)含有內(nèi)含子時能比cDNA的表達水平提高5~75倍[13]。而國內(nèi)學者盧一凡等的研究也得出類似的結(jié)論,并且證明了內(nèi)含子插入的位置對轉(zhuǎn)基因的表達沒有影響[14]。

        本實驗嘗試了將PCR擴增技術應用于DNA片段連接。一般情況下采用限制性內(nèi)切酶位點連接DNA。本研究在擴增GAL全長cDNA和將第二外顯子插入cDNA時采用了重疊延伸PCR。這樣既不需要考慮內(nèi)切酶位點,連接效率高,同時也沒有引入額外堿基,保持了正確的讀碼框,有利于基因表達。實驗進行了兩次重疊,第一次重疊是以cDNA的3個片段為模板的,所以擴增出的片段使重疊部分非常長,5′和3′重疊的部分分別為83bp和109bp,重疊延伸能有效進行;第二次重疊時內(nèi)含子和切開的cDNA片段的引物中均為重疊部分故有兩端都有50bp的重疊部分,重疊也能有效進行。

        大量的研究表明GAL在神經(jīng)生理學過程包括對促性腺激素的神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)、生長激素的分泌、認知功能和癲癇易感性等過程起了重要作用。近幾年來GAL轉(zhuǎn)基因動物模型被不同領域的研究人員用于各種生理病理研究,如疼痛、癲癇、空間學習能力等[15-17]。前期,人們對GAL模型的研究熱點主要集中于闡明這些GAL缺失表達或者過表達模型中某些疾病相關的生理、病理特征[18]。最近,研究者們開始探索GAL在生理病理過程中的作用機制[19]。GAL的功能是通過GAL受體GALR1,GALR2,GALR3中的一個或多個介導的,基于研究的需要,研究人員對GAL受體進行基因修飾構(gòu)建GALR基因敲除模型[20-22]。隨著GAL研究的深入,Lang R提出了GAL家族,包括GAL、GMAP、GAL樣肽、alarin和GAL受體家族[23]。

        本研究構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體采用一個在神經(jīng)生理學模型研究應用較為成熟和廣泛的血小板源性生長因子β鏈啟動子來控制GAL在神經(jīng)系統(tǒng)中過量表達,為構(gòu)建一個有效的GAL過表達轉(zhuǎn)基因,模型進行GAL的研究奠定了重要的基礎。

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