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        Vero及Vero-dst細(xì)胞對犬瘟熱病毒敏感性比較

        2011-02-16 14:55:04霍桂桃陳益山張?zhí)m蘭趙德明
        中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2011年1期
        關(guān)鍵詞:犬瘟熱細(xì)胞系毒株

        任 超,霍桂桃,陳益山,陳 麗,張?zhí)m蘭,李 佳,陳 武,趙德明

        (1.北京農(nóng)學(xué)院,獸醫(yī)學(xué)院(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 102206)

        犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus,CDV)引發(fā)的一種急性、高度接觸性致死性傳染病??筛腥救?、鼬科、浣熊科、大熊貓科、貓科(貓除外)等多種動(dòng)物。對我國養(yǎng)犬業(yè)、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)、動(dòng)物園觀賞動(dòng)物和野生動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等危害極大。近幾年來,在患Paget’s疾病的病人組織中也檢出了CDV的核酸[1]。另據(jù)Yoshikawa[2]報(bào)道猴子對本病也有一定的易感性,提示CDV還存在潛在易感宿主。

        CDV病毒的分離培養(yǎng)對診斷和研究該病至關(guān)重要。但是由于CDV對外界環(huán)境的抵抗力很弱,易被光和熱滅活,加之病料采集的部位、時(shí)間、樣品處理、發(fā)病動(dòng)物的抗體水平等因素致使體外分離培養(yǎng)CDV十分困難,但分離病毒所用細(xì)胞的敏感和有效性是成功分離CDV的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

        本實(shí)驗(yàn)選用Vero及Vero-dst兩種細(xì)胞,接種CDV標(biāo)準(zhǔn)毒株Snyder Hill和臨床陽性犬的組織,觀察細(xì)胞病變(Cyto pathetic effect,CPE)、檢測病毒滴度TCID50,并通過RT-PCR法進(jìn)行比較,觀察兩種細(xì)胞對CDV的敏感性,為CDV的分離鑒定、增殖培養(yǎng)及進(jìn)一步的深入研究提供依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        1.1.1 細(xì)胞與病毒:細(xì)胞系:Vero及Vero-dst(Vero.DogSLAMtag)細(xì)胞,中國農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)饋贈(zèng)。犬瘟熱病毒Snyder Hill株(ATCC,VR-1587)。犬瘟熱病毒野毒株:臨床CDV檢測陽性犬,于瀕死期實(shí)施安樂死,無菌采取其肺、肝、脾、腎組織。

        1.1.2 主要試劑與藥品:DMEM干粉(高糖):美國Gibico公司(批號1290007);D-Hank’s干粉:美國Sigma公司(批號1136551);胎牛血清(FBS):奧地利PAA公司(批號A04105-1121);胰蛋白酶:美國Gibico公司(批號2750018)。

        1.2 方法

        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):培養(yǎng)液為含有90%DMEM,10%FBS的完全培養(yǎng)液,待細(xì)胞長至70%~80%的融合狀態(tài)可接種病毒。將細(xì)胞傳至第三代,接種病毒。

        1.2.2 接種病毒

        1.2.2.1 CDV標(biāo)準(zhǔn)株:病毒的復(fù)蘇:犬瘟病毒Snyder Hill株(Titer:10(4.75)TCID50/0.2mL)置于37℃水浴中迅速解凍,使用維持培養(yǎng)液(98%DMEM為+2%FBS)根據(jù)其原始滴度將病毒原液分別按10-3、10-4、10-5進(jìn)行稀釋。按病毒接種的常規(guī)方法進(jìn)行[3]。

        1.2.2.2 野毒株:取病料小塊組織,按1∶5的比例加入PBS(pH 7.3),同時(shí)加入雙抗(1000IU/mL青鏈霉素溶液)充分研磨成勻漿。4℃冰箱內(nèi)感作2~4h或過夜后5000r/min離心10min,取上清。按上述接毒方法接入狀態(tài)良好的細(xì)胞上,觀察CPE。

        1.2.3 收毒:反復(fù)凍融的方法,即將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入-20℃冰箱凍后,直接取出,待其融化為冰水混合物時(shí),使勁搖晃瓶子,讓細(xì)胞破裂釋放出病毒顆粒,反復(fù)凍融4次后,將液體移入離心管,2000r/min離心10min,以此除去細(xì)胞碎片,離心后收集上清液,即達(dá)到收毒目的。

        1.2.4 盲傳:盲傳采用兩種方法,一為傳統(tǒng)接毒方法,即未出現(xiàn)CPE的細(xì)胞仍進(jìn)行收毒,收集的上清再繼續(xù)接種下一代細(xì)胞。以此盲傳5代。仍不見CPE者視為陰性。同時(shí)又嘗試了另外一種接毒方式,即傳代的同時(shí)進(jìn)行接毒,且消化細(xì)胞后不棄掉胰酶。

        1.2.5 分子生物學(xué)方法技術(shù)檢測感染細(xì)胞中的病毒核酸

        1.2.5.1 引物的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)Genbank上發(fā)表的CDV全序列,在保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對引物,擴(kuò)增片段為178bp。上游引物(P1):5′-GCCAGACCTGAG GAGTTATTGA-3′,下游引物(P2):5′-CTGCGTT ACAGACTTGATTTGC-3′。同時(shí),設(shè)計(jì)了Vero細(xì)胞的GAPDH,擴(kuò)增片段192bp。上游引物(P1):5′-TCAACAGCGACACCCACTC-3′,下游引物(P2):5′-CTTCCTCTTGTGCTCTTGCT-3′。以上引物均由上海生工北京合成部合成。

        1.2.5.2 RNA的提?。篢rizol法。

        1.2.5.3 RT-PCR擴(kuò)增:提取總RNA后立即反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,采用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScriptⅡFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix。后將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,條件為94℃5min,94℃30s,53℃30s,72℃30s,30cycles,72℃10min,退火溫度為53℃。

        1.2.5.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定:瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

        1.2.6 病毒滴度(TCID50)的測定:用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行毒價(jià)測定。將在不同細(xì)胞上接種CDV后收獲的病毒液分別做10-1~10-10倍梯度稀釋,每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔,每孔加入不同稀釋度的病毒液100μL。37℃,CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h,1h后棄去吸附的病毒液,換為維持液繼續(xù)培養(yǎng),逐日觀察記錄CPE中狀況。根據(jù)Reed-Munch法計(jì)算。

        2 結(jié)果

        2.1 CDV標(biāo)準(zhǔn)株Snyder Hill株在兩種細(xì)胞中的培養(yǎng)情況(表1及彩插1圖1)

        Vero-dst cells:第一代即出現(xiàn)CPE,表現(xiàn)為出現(xiàn)合胞體、空泡且細(xì)胞變圓、脫落。同時(shí)于接毒后6h、12h、18h、24h、36h、48h監(jiān)測CPE情況,病變約在培養(yǎng)12h后出現(xiàn),且在24h后病變率為100%。而后繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全部脫落死亡。

        Vero cells:第一代未出現(xiàn)CPE,進(jìn)行盲傳。盲傳10代始終未出現(xiàn)CPE,視為陰性。

        2.2 野毒在兩種細(xì)胞中的培養(yǎng)情況(表1及彩插1圖1)

        Vero-dst cells:第一代即出現(xiàn)CPE,表現(xiàn)為出現(xiàn)合胞體、空泡且細(xì)胞變圓、脫落。同時(shí)于接毒后6h、12h、18h、24h、36h、48h觀察CPE情況,病變約在培養(yǎng)12h后出現(xiàn),且在24h后病變率為100%。而后繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全部脫落死亡。

        Vero cells:首代未出現(xiàn)CPE,進(jìn)行盲傳。盲傳10代始終未出現(xiàn)CPE,視為陰性。

        表1 Snyder Hill株與野毒株在Vero-dst及Vero細(xì)胞中CPE情況Tab.1 The CPE of Vero-dst cells and Vero cells after infection of CDV

        2.3 RT-PCR

        CDV標(biāo)準(zhǔn)株及野毒株的Vero-dst細(xì)胞培養(yǎng)物中擴(kuò)增出了CDV基因片段(178bp),而Vero細(xì)胞培養(yǎng)物中未擴(kuò)增出相應(yīng)基因片段(圖2)。

        2.4 Snyder Hill株與野毒株病毒毒力測定

        經(jīng)過毒力測定,CDV標(biāo)準(zhǔn)株Snyder Hill株經(jīng)培養(yǎng)后TCID50為10-4.25/0.2mL;野毒株為10-4.95/0.2mL,由此可見,野毒株毒力比標(biāo)準(zhǔn)株較強(qiáng)。

        3 討論

        目前,分離CDV用的組織細(xì)胞主要有原代細(xì)胞及傳代細(xì)胞系兩大類。原代培養(yǎng)細(xì)胞有犬或貂的肺和腹腔巨噬細(xì)胞、腎細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、犬腦細(xì)胞(DB)、犢牛的腎細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞、牛胚胎肺細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞(CEF),其中CEF應(yīng)用最多。其中最有效的方法是用幼犬或雪貂的肺巨噬細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。但由于原代細(xì)胞制備過程繁瑣且很容易污染,故分離CDV多用傳代細(xì)胞。分離CDV所使用的傳代細(xì)胞系有犬腎細(xì)胞系(MDCK)、貓胚胎細(xì)胞系(FE)、貓腎細(xì)胞系(CRFK)、乳倉鼠胎腎細(xì)胞系(BHK-21)、非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero)及其克隆株(Vero E6)、BGMK細(xì)胞系、絨猴B淋巴細(xì)胞系(B95a)、人子宮頸癌細(xì)胞系(Hela)、人喉頭癌細(xì)胞系(HEP-2)、CV-1(Tc7 clone)細(xì)胞系、Bsc-1細(xì)胞系、兔腎細(xì)胞系(RK13)、BD細(xì)胞系等。近年來,用Vero細(xì)胞分離培養(yǎng)CDV被認(rèn)為是首選細(xì)胞[5]。而據(jù)Seki等[6]的研究顯示,vero細(xì)胞在分離犬瘟熱野毒株時(shí)并未表現(xiàn)出細(xì)胞適性,即未見CPE。另有報(bào)道稱用vero細(xì)胞分離CDV時(shí)需要多次盲傳并添加胰酶,才有可能出現(xiàn)CPE,這樣就給CDV的研究帶來不便。在國外某些實(shí)驗(yàn)室,他們使用來源于狨猴淋巴細(xì)胞的B95a細(xì)胞系來分離CDV,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此細(xì)胞無論在敏感性還是CPE類型上都優(yōu)于其他細(xì)胞,而且分離到的CDV野毒保留了其對宿主動(dòng)物的致病性。但B95a細(xì)胞做為一種被EB病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系,在操作過程中會釋放EB病毒,這就涉及了生物安全的問題,因此該類細(xì)胞系難以得到推廣應(yīng)用。

        圖2 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The result s of RT-PCR amplification

        因此,如何選用敏感細(xì)胞是首要的問題。病毒感染細(xì)胞的第一步即病毒與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合,病毒通過細(xì)胞表面識別此類病毒的受體粘附于細(xì)胞繼而侵入細(xì)胞,與細(xì)胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合是病毒感染復(fù)制過程中的始動(dòng)環(huán)節(jié),是決定病毒的宿主特異性、組織嗜性及致病性的主要因素之一,即受體決定病毒的細(xì)胞嗜性[7]。近年來,信號淋巴激活分子(SLAM,CD150)研究很多,其被認(rèn)為是麻疹病毒感染細(xì)胞時(shí)宿主動(dòng)物識別的細(xì)胞受體。有報(bào)道稱,SLAM(CD150)是CDV等麻疹病毒的受體[8,9],SLAM(CD150)表達(dá)于未成熟的胸腺細(xì)胞、激活的T和B細(xì)胞及巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表面[10]。而CDV通過識別SLAM(CD150)而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。而Seki等人[6]的研究也表明應(yīng)用能夠穩(wěn)定表達(dá)犬SLAM的Vero-dst細(xì)胞系較Vero或B95a細(xì)胞系能快速且敏感地分離出CDV野毒株,因此該細(xì)胞系可以用來體外研究CDV野毒株的生物學(xué)特性。Wenzilow等[11]的實(shí)驗(yàn)通過檢測足墊、淋巴結(jié)、肺及腦組織,發(fā)現(xiàn)患有犬瘟熱的病犬各組織中SLAM受體的表達(dá)量遠(yuǎn)高于正常犬,且差異十分顯著。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),在試驗(yàn)感染的犬中,各組織SLAM表達(dá)量在感染初期急劇上調(diào)。這種受體表達(dá)的上調(diào)導(dǎo)致了CDV感染更多的敏感細(xì)胞,進(jìn)而使病毒大量增殖,最終引起組織損傷。由此可見,在進(jìn)行CDV分離或是培養(yǎng)增殖的過程中,SLAM受體無疑起到了至關(guān)重要的作用。

        通過本實(shí)驗(yàn)也可以看出,穩(wěn)定表達(dá)犬SLAM的Vero-dst細(xì)胞對于CDV十分敏感,且出現(xiàn)CPE的時(shí)間短。而未表達(dá)SLAM的Vero細(xì)胞始終未見敏感性,這與國外的相關(guān)研究一致。

        縱觀國內(nèi)許多研究,均提到使用vero細(xì)胞可從病料中成功分離到CDV[12-14],而本研究曾多次反復(fù)嘗試,均未成功分離,故從本實(shí)驗(yàn)中可以看到,目前本實(shí)驗(yàn)室所使用的vero細(xì)胞在CDV的分離培養(yǎng)中并未表現(xiàn)良好的適應(yīng)性。由此可見對于病毒體外研究,敏感細(xì)胞不可或缺。對于CDV的研究,能夠穩(wěn)定表達(dá)犬SLAM受體的細(xì)胞系的建立解決了這個(gè)問題。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出,無論是對分離的CDV野毒株還是增殖培養(yǎng)的CDV標(biāo)準(zhǔn)株,Vero-dst細(xì)胞較Vero細(xì)胞均表現(xiàn)處理良好的細(xì)胞嗜性。對此,國內(nèi)報(bào)道說法不一,且未見將Vero-dst細(xì)胞與Vero細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)比較。

        本實(shí)驗(yàn)通過Vero及Vero-dst兩種細(xì)胞對CDV敏感性對比,提示穩(wěn)定表達(dá)犬SLAM的Vero-dst細(xì)胞對于CDV較敏感,且CPE出現(xiàn)所需時(shí)間短,是分離CDV較為理想的細(xì)胞系。

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