任 超，霍桂桃，陳益山，陳 麗，張?zhí)m蘭，李 佳，陳 武，趙德明

（1.北京農(nóng)學(xué)院，獸醫(yī)學(xué)院（中醫(yī)藥）北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 102206）

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）引發(fā)的一種急性、高度接觸性致死性傳染病。可感染犬科、鼬科、浣熊科、大熊貓科、貓科（貓除外）等多種動(dòng)物。對(duì)我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)、動(dòng)物園觀賞動(dòng)物和野生動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等危害極大。近幾年來(lái)，在患Paget’s疾病的病人組織中也檢出了CDV的核酸［1］。另?yè)?jù)Yoshikawa［2］報(bào)道猴子對(duì)本病也有一定的易感性，提示CDV還存在潛在易感宿主。

CDV病毒的分離培養(yǎng)對(duì)診斷和研究該病至關(guān)重要。但是由于CDV對(duì)外界環(huán)境的抵抗力很弱，易被光和熱滅活，加之病料采集的部位、時(shí)間、樣品處理、發(fā)病動(dòng)物的抗體水平等因素致使體外分離培養(yǎng)CDV十分困難，但分離病毒所用細(xì)胞的敏感和有效性是成功分離CDV的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)選用Vero及Vero-dst兩種細(xì)胞，接種CDV標(biāo)準(zhǔn)毒株Snyder Hill和臨床陽(yáng)性犬的組織，觀察細(xì)胞病變（Cyto pathetic effect，CPE）、檢測(cè)病毒滴度TCID50，并通過(guò)RT-PCR法進(jìn)行比較，觀察兩種細(xì)胞對(duì)CDV的敏感性，為CDV的分離鑒定、增殖培養(yǎng)及進(jìn)一步的深入研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與病毒：細(xì)胞系：Vero及Vero-dst（Vero.DogSLAMtag）細(xì)胞，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)饋贈(zèng)。犬瘟熱病毒Snyder Hill株（ATCC，VR-1587）。犬瘟熱病毒野毒株：臨床CDV檢測(cè)陽(yáng)性犬，于瀕死期實(shí)施安樂(lè)死，無(wú)菌采取其肺、肝、脾、腎組織。

1.1.2 主要試劑與藥品：DMEM干粉（高糖）：美國(guó)Gibico公司（批號(hào)1290007）；D-Hank’s干粉：美國(guó)Sigma公司（批號(hào)1136551）；胎牛血清（FBS）：奧地利PAA公司（批號(hào)A04105-1121）；胰蛋白酶：美國(guó)Gibico公司（批號(hào)2750018）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：培養(yǎng)液為含有90％DMEM，10％FBS的完全培養(yǎng)液，待細(xì)胞長(zhǎng)至70％～80％的融合狀態(tài)可接種病毒。將細(xì)胞傳至第三代，接種病毒。

1.2.2 接種病毒

1.2.2.1 CDV標(biāo)準(zhǔn)株：病毒的復(fù)蘇：犬瘟病毒Snyder Hill株（Titer：10（4.75）TCID50/0.2mL）置于37℃水浴中迅速解凍，使用維持培養(yǎng)液（98％DMEM為+2％FBS）根據(jù)其原始滴度將病毒原液分別按10-3、10-4、10-5進(jìn)行稀釋。按病毒接種的常規(guī)方法進(jìn)行［3］。

1.2.2.2 野毒株：取病料小塊組織，按1∶5的比例加入PBS（pH 7.3），同時(shí)加入雙抗（1000IU/mL青鏈霉素溶液）充分研磨成勻漿。4℃冰箱內(nèi)感作2～4h或過(guò)夜后5000r/min離心10min，取上清。按上述接毒方法接入狀態(tài)良好的細(xì)胞上，觀察CPE。

1.2.3 收毒：反復(fù)凍融的方法，即將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入-20℃冰箱凍后，直接取出，待其融化為冰水混合物時(shí)，使勁搖晃瓶子，讓細(xì)胞破裂釋放出病毒顆粒，反復(fù)凍融4次后，將液體移入離心管，2000r/min離心10min，以此除去細(xì)胞碎片，離心后收集上清液，即達(dá)到收毒目的。

1.2.4 盲傳：盲傳采用兩種方法，一為傳統(tǒng)接毒方法，即未出現(xiàn)CPE的細(xì)胞仍進(jìn)行收毒，收集的上清再繼續(xù)接種下一代細(xì)胞。以此盲傳5代。仍不見(jiàn)CPE者視為陰性。同時(shí)又嘗試了另外一種接毒方式，即傳代的同時(shí)進(jìn)行接毒，且消化細(xì)胞后不棄掉胰酶。

1.2.5 分子生物學(xué)方法技術(shù)檢測(cè)感染細(xì)胞中的病毒核酸

1.2.5.1 引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)Genbank上發(fā)表的CDV全序列，在保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，擴(kuò)增片段為178bp。上游引物（P1）：5′-GCCAGACCTGAG GAGTTATTGA-3′，下游引物（P2）：5′-CTGCGTT ACAGACTTGATTTGC-3′。同時(shí)，設(shè)計(jì)了Vero細(xì)胞的GAPDH，擴(kuò)增片段192bp。上游引物（P1）：5′-TCAACAGCGACACCCACTC-3′，下游引物（P2）：5′-CTTCCTCTTGTGCTCTTGCT-3′。以上引物均由上海生工北京合成部合成。

1.2.5.2 RNA的提取：Trizol法。

1.2.5.3 RT-PCR擴(kuò)增：提取總RNA后立即反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScriptⅡFirst-Strand cDNA Synthesis SuperMix。后將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為94℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃30s，30cycles，72℃10min，退火溫度為53℃。

1.2.5.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定：瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.2.6 病毒滴度（TCID50）的測(cè)定：用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行毒價(jià)測(cè)定。將在不同細(xì)胞上接種CDV后收獲的病毒液分別做10-1～10-10倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，每孔加入不同稀釋度的病毒液100μL。37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h，1h后棄去吸附的病毒液，換為維持液繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察記錄CPE中狀況。根據(jù)Reed-Munch法計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 CDV標(biāo)準(zhǔn)株Snyder Hill株在兩種細(xì)胞中的培養(yǎng)情況（表1及彩插1圖1）

Vero-dst cells：第一代即出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為出現(xiàn)合胞體、空泡且細(xì)胞變圓、脫落。同時(shí)于接毒后6h、12h、18h、24h、36h、48h監(jiān)測(cè)CPE情況，病變約在培養(yǎng)12h后出現(xiàn)，且在24h后病變率為100％。而后繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全部脫落死亡。

Vero cells：第一代未出現(xiàn)CPE，進(jìn)行盲傳。盲傳10代始終未出現(xiàn)CPE，視為陰性。

2.2 野毒在兩種細(xì)胞中的培養(yǎng)情況（表1及彩插1圖1）

Vero-dst cells：第一代即出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為出現(xiàn)合胞體、空泡且細(xì)胞變圓、脫落。同時(shí)于接毒后6h、12h、18h、24h、36h、48h觀察CPE情況，病變約在培養(yǎng)12h后出現(xiàn)，且在24h后病變率為100％。而后繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全部脫落死亡。

Vero cells：首代未出現(xiàn)CPE，進(jìn)行盲傳。盲傳10代始終未出現(xiàn)CPE，視為陰性。

表1 Snyder Hill株與野毒株在Vero-dst及Vero細(xì)胞中CPE情況Tab.1 The CPE of Vero-dst cells and Vero cells after infection of CDV

2.3 RT-PCR

CDV標(biāo)準(zhǔn)株及野毒株的Vero-dst細(xì)胞培養(yǎng)物中擴(kuò)增出了CDV基因片段（178bp），而Vero細(xì)胞培養(yǎng)物中未擴(kuò)增出相應(yīng)基因片段（圖2）。

2.4 Snyder Hill株與野毒株病毒毒力測(cè)定

經(jīng)過(guò)毒力測(cè)定，CDV標(biāo)準(zhǔn)株Snyder Hill株經(jīng)培養(yǎng)后TCID50為10-4.25/0.2mL；野毒株為10-4.95/0.2mL，由此可見(jiàn)，野毒株毒力比標(biāo)準(zhǔn)株較強(qiáng)。

3 討論

目前，分離CDV用的組織細(xì)胞主要有原代細(xì)胞及傳代細(xì)胞系兩大類。原代培養(yǎng)細(xì)胞有犬或貂的肺和腹腔巨噬細(xì)胞、腎細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、犬腦細(xì)胞（DB）、犢牛的腎細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞、牛胚胎肺細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），其中CEF應(yīng)用最多。其中最有效的方法是用幼犬或雪貂的肺巨噬細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。但由于原代細(xì)胞制備過(guò)程繁瑣且很容易污染，故分離CDV多用傳代細(xì)胞。分離CDV所使用的傳代細(xì)胞系有犬腎細(xì)胞系（MDCK）、貓胚胎細(xì)胞系（FE）、貓腎細(xì)胞系（CRFK）、乳倉(cāng)鼠胎腎細(xì)胞系（BHK-21）、非洲綠猴腎細(xì)胞系（Vero）及其克隆株（Vero E6）、BGMK細(xì)胞系、絨猴B淋巴細(xì)胞系（B95a）、人子宮頸癌細(xì)胞系（Hela）、人喉頭癌細(xì)胞系（HEP-2）、CV-1（Tc7 clone）細(xì)胞系、Bsc-1細(xì)胞系、兔腎細(xì)胞系（RK13）、BD細(xì)胞系等。近年來(lái)，用Vero細(xì)胞分離培養(yǎng)CDV被認(rèn)為是首選細(xì)胞［5］。而據(jù)Seki等［6］的研究顯示，vero細(xì)胞在分離犬瘟熱野毒株時(shí)并未表現(xiàn)出細(xì)胞適性，即未見(jiàn)CPE。另有報(bào)道稱用vero細(xì)胞分離CDV時(shí)需要多次盲傳并添加胰酶，才有可能出現(xiàn)CPE，這樣就給CDV的研究帶來(lái)不便。在國(guó)外某些實(shí)驗(yàn)室，他們使用來(lái)源于狨猴淋巴細(xì)胞的B95a細(xì)胞系來(lái)分離CDV，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此細(xì)胞無(wú)論在敏感性還是CPE類型上都優(yōu)于其他細(xì)胞，而且分離到的CDV野毒保留了其對(duì)宿主動(dòng)物的致病性。但B95a細(xì)胞做為一種被EB病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系，在操作過(guò)程中會(huì)釋放EB病毒，這就涉及了生物安全的問(wèn)題，因此該類細(xì)胞系難以得到推廣應(yīng)用。

圖2 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The result s of RT-PCR amplification

因此，如何選用敏感細(xì)胞是首要的問(wèn)題。病毒感染細(xì)胞的第一步即病毒與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合，病毒通過(guò)細(xì)胞表面識(shí)別此類病毒的受體粘附于細(xì)胞繼而侵入細(xì)胞，與細(xì)胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合是病毒感染復(fù)制過(guò)程中的始動(dòng)環(huán)節(jié)，是決定病毒的宿主特異性、組織嗜性及致病性的主要因素之一，即受體決定病毒的細(xì)胞嗜性［7］。近年來(lái)，信號(hào)淋巴激活分子（SLAM，CD150）研究很多，其被認(rèn)為是麻疹病毒感染細(xì)胞時(shí)宿主動(dòng)物識(shí)別的細(xì)胞受體。有報(bào)道稱，SLAM（CD150）是CDV等麻疹病毒的受體［8，9］，SLAM（CD150）表達(dá)于未成熟的胸腺細(xì)胞、激活的T和B細(xì)胞及巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞表面［10］。而CDV通過(guò)識(shí)別SLAM（CD150）而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。而Seki等人［6］的研究也表明應(yīng)用能夠穩(wěn)定表達(dá)犬SLAM的Vero-dst細(xì)胞系較Vero或B95a細(xì)胞系能快速且敏感地分離出CDV野毒株，因此該細(xì)胞系可以用來(lái)體外研究CDV野毒株的生物學(xué)特性。Wenzilow等［11］的實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)足墊、淋巴結(jié)、肺及腦組織，發(fā)現(xiàn)患有犬瘟熱的病犬各組織中SLAM受體的表達(dá)量遠(yuǎn)高于正常犬，且差異十分顯著。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)感染的犬中，各組織SLAM表達(dá)量在感染初期急劇上調(diào)。這種受體表達(dá)的上調(diào)導(dǎo)致了CDV感染更多的敏感細(xì)胞，進(jìn)而使病毒大量增殖，最終引起組織損傷。由此可見(jiàn)，在進(jìn)行CDV分離或是培養(yǎng)增殖的過(guò)程中，SLAM受體無(wú)疑起到了至關(guān)重要的作用。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)也可以看出，穩(wěn)定表達(dá)犬SLAM的Vero-dst細(xì)胞對(duì)于CDV十分敏感，且出現(xiàn)CPE的時(shí)間短。而未表達(dá)SLAM的Vero細(xì)胞始終未見(jiàn)敏感性，這與國(guó)外的相關(guān)研究一致。

縱觀國(guó)內(nèi)許多研究，均提到使用vero細(xì)胞可從病料中成功分離到CDV［12-14］，而本研究曾多次反復(fù)嘗試，均未成功分離，故從本實(shí)驗(yàn)中可以看到，目前本實(shí)驗(yàn)室所使用的vero細(xì)胞在CDV的分離培養(yǎng)中并未表現(xiàn)良好的適應(yīng)性。由此可見(jiàn)對(duì)于病毒體外研究，敏感細(xì)胞不可或缺。對(duì)于CDV的研究，能夠穩(wěn)定表達(dá)犬SLAM受體的細(xì)胞系的建立解決了這個(gè)問(wèn)題。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，無(wú)論是對(duì)分離的CDV野毒株還是增殖培養(yǎng)的CDV標(biāo)準(zhǔn)株，Vero-dst細(xì)胞較Vero細(xì)胞均表現(xiàn)處理良好的細(xì)胞嗜性。對(duì)此，國(guó)內(nèi)報(bào)道說(shuō)法不一，且未見(jiàn)將Vero-dst細(xì)胞與Vero細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)比較。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Vero及Vero-dst兩種細(xì)胞對(duì)CDV敏感性對(duì)比，提示穩(wěn)定表達(dá)犬SLAM的Vero-dst細(xì)胞對(duì)于CDV較敏感，且CPE出現(xiàn)所需時(shí)間短，是分離CDV較為理想的細(xì)胞系。

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