李 娜，張 周

（中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203）

合適的糖尿病動物模型在糖尿病的發(fā)病機(jī)制研究及其并發(fā)癥的治療、藥物的開發(fā)過程中都發(fā)揮著極其重要的作用。國內(nèi)外諸多學(xué)者均對KK小鼠或db/db小鼠的典型糖尿病特征進(jìn)行研究，但卻未對其進(jìn)行比較分析，故本實驗采用發(fā)病過程與人類糖尿病極其相似的自發(fā)性2型糖尿病動物模型KKAy/Ta和C57BL/KsJ-db/db小鼠為研究對象，對其體重、血糖、胰島素、臟器系數(shù)以及部分臟器病理學(xué)變化等生物學(xué)特性進(jìn)行分析比較，為糖尿病病因及治療方法的研究提供基礎(chǔ)資料以便選擇合適的動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：實驗動物分為4組，分別為：糖尿病模型KK-Ay/Ta（以下簡稱KK）小鼠及對照組C57BL/6JSlac（以下簡稱C57）小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司［SCXK（滬）2007-0005］；糖尿病模型C57BL/KsJ-db/db（以下簡稱db/db）小鼠及對照組C57BL/KsJ-db/+（以下簡稱db/+）小鼠，由美國JACKSON實驗室引進(jìn)的db/+小鼠在中國科學(xué)院上海藥物研究所交配繁殖的后代［SCXK（滬）2008-0017］；每組小鼠20只，雌雄各半，飼養(yǎng)于本單位動物屏障環(huán)境內(nèi)［SYXK（滬）2008-0049］；溫度控制在20℃～25℃之間，日溫差≤3℃；相對濕度控制在40％～70％之間；每日12h光照維持，晝夜循環(huán)；自由進(jìn)食、飲水，配合飼料（121℃高溫高壓滅菌25min）含粗蛋白20.5％、粗脂肪4.6％、粗纖維3.0％、鈣1.4％、總磷0.9％，購自上海仕林生物科技有限公司［飼料生產(chǎn)企業(yè)審查合格證編號：滬飼審（2008）04031］。

1.1.2 試劑：胰島素試劑盒（美國CRYSTAL CHEM公司生產(chǎn)）、甲醛溶液、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉。

1.1.3 儀器設(shè)備：OneTouch UltraTM血糖儀、OneTouch UltraTM試紙、分析天平、電子天平、毛細(xì)管、離心機(jī)、酶標(biāo)儀、顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗周期：KK及對照組C57小鼠從6周齡開始，實驗至30周齡結(jié)束；db/db及對照組db/+小鼠從4周齡開始實驗，至20周齡結(jié)束。在各自實驗周期內(nèi)，每2周測定模型小鼠與對照組小鼠的體重、血糖、血清胰島素水平；實驗結(jié)束后處死，分離心、肝、脾、腎、胰腺、腎周脂肪、皮下脂肪、腸系膜脂肪以及肩胛骨脂肪，稱重并計算臟器/脂肪系數(shù)；另對腎臟、肝臟和胰腺進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.2 體重與糖代謝比較：每2周測定實驗小鼠體重與血糖值，分析比較不同年齡、不同性別的模型組與對照組小鼠體生長曲線和糖代謝曲線，分析各模型間達(dá)到血糖值異常的時間差異及峰值比較；血糖直接采用血糖儀測定尾靜脈血。

1.2.3 血清胰島素的比較：在各自實驗周期內(nèi)，每2周眼眶采血200μL，3500r/min離心15min，取血清，-20℃保存，采用放射免疫分析法測定胰島素水平。

1.2.4 主要臟器、脂肪重量及臟器、脂肪系數(shù)的測定：實驗結(jié)束后，分別處死各實驗組及對照組小鼠，分離心、肝、脾、腎、胰腺、腎周脂肪、皮下脂肪、腸系膜脂肪以及肩胛骨脂肪，稱重；各臟器和脂肪重量以g為單位，臟器（脂肪）系數(shù)以臟器（脂肪）重量/體重×100％表示。

1.2.5 組織形態(tài)學(xué)觀察：分別將各實驗組及對照組小鼠的腎臟、肝臟和胰腺固定于10％中性福爾馬林溶液中＞24h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，用高倍鏡觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用Mean±SE表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。差異顯著性采用獨立樣本t檢驗和單因子方差分析。

2 結(jié)果

2.1 體重的比較

KK和對照組C57小鼠、db/db和對照組db/+表型正常小鼠的體重均隨著年齡的增長而增加，并分別于6周齡和8周齡開始與其對照組相比差異顯著（P＜0.05），且同品系小鼠間雄性小鼠體重高于雌性，經(jīng)分析可得出：自14周齡開始KK小鼠雌雄間相比差異顯著（P＜0.05），db/db小鼠在整個實驗周期內(nèi)均呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）；而兩品系間相比又可得出：KK小鼠體重遠(yuǎn)高于db/db小鼠（P＜0.05），雄性KK小鼠體重最高達(dá)51.21±1.93g，雌性KK小鼠體重最高達(dá)42.73±2.76g；但雄性db/db小鼠則最高達(dá)38.69±3.66g，雌性最高值為35.64±3.48g（表1）。

表1 糖尿病模型KK與db/db小鼠體重（g）Tab.1 Body weight of diabetic KK and db/db mice（g）

2.2 血糖的比較

在整個實驗周期內(nèi)，KK小鼠血糖值與對照組呈顯著差異（P＜0.05），雄性小鼠在10周齡時出現(xiàn)血糖異常癥狀（血糖≥13.9mmol/L），之后快速升高于12周齡達(dá)到最高值便逐漸降低但一直維持較高水平直至實驗結(jié)束；而雌性小鼠于12周齡時出現(xiàn)血糖異?，F(xiàn)象，持續(xù)升高于18周齡達(dá)到最高值；另外，同周齡間的雄性小鼠血糖值明顯大于雌性小鼠（P＜0.05），其最高值分別為31.11±3.10和25.50±2.28mmol/L。db/db小鼠則在8周齡時就出現(xiàn)血糖異常癥狀并維持至實驗結(jié)束，同樣雄性小鼠的血糖值遠(yuǎn)大于雌性小鼠（P＜0.05）。db/db小鼠出現(xiàn)血糖異常比KK早，且初期血糖值遠(yuǎn)高于KK小鼠（P＜0.05），雌雄分別于12周齡和18周齡開始與KK小鼠處于相當(dāng)水平，最高值可分別達(dá)到29.92±1.45和27.77±1.70mmol/L（表2）。

2.3 血清胰島素的比較

在整個實驗周期內(nèi)，糖尿病模型KK與db/db小鼠與各自對照組均呈現(xiàn)顯著的差異（P＜0.05），且KK小鼠從6周齡開始就一直處于高胰島素水平狀態(tài)（≥10ng/mL），并很快達(dá)到峰值，而雄性和雌性db/db小鼠則分別于8周齡和10周齡開始處在高胰島素水平狀態(tài)至實驗結(jié)束；而同品系的雌雄小鼠間血清胰島素水平則基本上沒有差異（P＞0.05）；另外，同周齡內(nèi)KK小鼠的血清胰島素水平明顯高于db/db小鼠（P＜0.05），雄、雌性KK小鼠的最高值分別為61.99±12.20ng/mL和62.35±15.61ng/mL，db/db小鼠分別為18.84±4.11ng/mL和17.03±3.71ng/mL（表3）。

2.4 主要臟器、脂肪重量及其臟器、脂肪系數(shù)的比較

2.4.1 臟器、脂肪重量比較

由結(jié)果（表4）分析得出，KK小鼠與其對照組相比，所有臟器、脂肪重量和體重差異顯著（P＜0.05）；同時，雄性KK小鼠的體重、肝臟、腎周脂肪、皮下脂肪、腸系膜脂肪和肩胛骨脂肪均明顯大于雌性小鼠（P＜0.05）。db/db與其對照組相比，部分臟器（如雄性的肝臟、脾臟，雌性的心臟、肝臟、脾臟和腎臟）以及所測脂肪的重量均呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）；而不同性別的db/db小鼠間除脾臟外，其余臟器以及脂肪重量均沒有顯著差異（P＞0.05）。另外雄性KK小鼠的體重、心臟、脾臟以及胰腺重量明顯大于db/db小鼠（P＜0.05），但皮下脂肪和肩胛骨脂肪的重量則小于db/db小鼠（P＜0.05）；雌性KK小鼠體重、脾臟、胰腺、腎臟的重量大于db/db小鼠（P＜0.05），而腎周脂肪、皮下脂肪和肩胛骨脂肪的重量則遠(yuǎn)小于db/db小鼠（P＜0.05）。

表2 糖尿病模型KK與db/db小鼠血糖（mmol/L）Tab.2 Glucose of diabetic KK and db/db mice（mmol/L）

表3 糖尿病模型KK與db/db小鼠血清胰島素（ng/mL）Tab.3 Serum insulin of diabetic KK and db/db mice（ng/mL）

2.4.2 臟器、脂肪系數(shù)比較

由結(jié)果分析可得出（表5），雄性KK小鼠的脂肪系數(shù)大于雌性小鼠，且均大于對照組（P＜0.05），但所測臟器則呈現(xiàn)不同程度的萎縮，尤其是雄性小鼠的心臟和腎臟萎縮程度明顯大于雌性小鼠（P＜0.05）。同樣db/db小鼠的脂肪系數(shù)也大于對照組（P＜0.05），且脾臟和胰腺也呈現(xiàn)不同程度的萎縮，但是雌雄間則沒有明顯的差異（P＞0.05）。另外db/db和KK小鼠相比表明，db/db小鼠脾臟和胰腺的萎縮程度明顯大于KK小鼠（P＜0.05），而KK小鼠肝臟的萎縮程度則大于db/db小鼠（P＜0.05），同時db/db小鼠的脂肪系數(shù)則遠(yuǎn)大于KK小鼠（P＜0.05）。

表4 糖尿病模型KK和db/db小鼠的臟器、脂肪重量（g）Tab.4 Organ and adipose weight of diabetic KK and db/db mice（g）

表5 糖尿病模型KK和db/db小鼠的臟器、脂肪系數(shù)（％）Tab.5 Organ and adipose coefficient of diabetic KK and db/db mice（％）

2.5 組織病理學(xué)變化

各糖尿病模型和對照組相比，腎小球內(nèi)玻璃樣變性、血管基底膜增厚、腎小管腔內(nèi)透明管型、腎小管上皮細(xì)胞脂肪變性，且腎間質(zhì)組織輕度充血、水腫，炎細(xì)胞浸潤；肝細(xì)胞大片壞死、伴隨有大量炎細(xì)胞浸潤以及纖維組織增生，肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變性；胰島數(shù)量明顯減少、體積縮小，且島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量也相對減少、體積縮小，部分胰島完全萎縮、崩解（彩圖見封2）。

3 討論

自發(fā)性2型糖尿病動物模型是指實驗動物未經(jīng)任何有意識的人工處理、在自然狀態(tài)下發(fā)生以高血糖、胰島素抵抗為主要特征的糖尿病模型，KK-Ay/Ta小鼠和db/db小鼠均是目前應(yīng)用于人類2型糖尿病研究適用的自發(fā)性動物模型，KK-Ay/Ta小鼠是一種毛色基因（Ay）突變的2型糖尿病動物模型，Ay基因不僅影響小鼠的毛色而且可引起代謝紊亂，出現(xiàn)高飲食［1］、肥胖、高血糖、脂質(zhì)代謝紊亂和和高胰島素血癥；db/db小鼠則是由美國Jackson實驗室于1966年在C57BL/Ks小鼠上發(fā)現(xiàn)的帶有糖尿病突變基因（db）的動物，該品系純合子小鼠早期發(fā)育時就會出現(xiàn)顯性糖尿病征兆。本實驗設(shè)計兩種品系糖尿病小鼠的起止周齡不一致，是因為作者結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)報道以及早期預(yù)實驗而定，如Ito［2］研究得出KK小鼠于12周齡后體重、隨機(jī)血糖等指標(biāo)均明顯高于對照組，出現(xiàn)典型的2型糖尿病癥狀，另有研究表明db/db小鼠于早期即出現(xiàn)糖尿病癥狀，故本實驗于6周齡和4周齡開始監(jiān)測KK和db/db小鼠各項指標(biāo)，同時研究得出db/db小鼠于16周齡即出現(xiàn)血糖和胰島素水平下降癥狀，即于20周齡結(jié)束db/db小鼠的實驗。

實驗研究得出KK小鼠體重遠(yuǎn)高于db/db小鼠，體重最高值相差可達(dá)12g（雄性）與7g左右（雌性），且與對照組相比KK小鼠出現(xiàn)顯著差異比db/db小鼠早，于6周齡即出現(xiàn)明顯的體重異常。Amy［3］研究報道db/db小鼠的最高體重可達(dá)41.10±5.63g，Toshihiro［4］的研究中表明雌雄KK-Ay小鼠的平均體重在45g左右，較db/db小鼠高，與本實驗結(jié)果基本保持一致。

將血糖值進(jìn)行比較則得出db/db小鼠出現(xiàn)血糖異常比KK早，且發(fā)病早期就呈現(xiàn)高血糖，早期血糖值比KK小鼠高，血糖變化曲線圖穩(wěn)定，而KK小鼠發(fā)病后期可較長時間的維持血糖異常，維持時間較db/db小鼠長。Amy［3］的研究報道也表明出db/db小鼠的隨即血糖可達(dá)559±77mg/dl，即31.06±4.28mmol/L；而Satomi［5］研究得出KK小鼠的血糖最高值平均可達(dá)410mg/dl，即22.78mmol/L；同時Toshihiro［4］的研究也表明KK-Ay小鼠的血糖值可維持在400mg/dl左右。以上結(jié)果均與本實驗基本一致，綜合可得出KK小鼠的血糖值較db/db小鼠要低。

兩品系小鼠均呈現(xiàn)出高胰島素血癥，Tsukuda［6］研究分析該現(xiàn)象是由于大腦中過氧化物酶缺乏，持續(xù)的高胰島素分泌導(dǎo)致胰島素β細(xì)胞分泌較正常多幾倍甚至十幾倍來降低血糖，如此反復(fù)從而導(dǎo)致高胰島素血癥。另外實驗得出KK小鼠出現(xiàn)血清胰島素水平異常比db/db小鼠早，且遠(yuǎn)高于db/db小鼠，從實驗開始就呈現(xiàn)極高的血清胰島素水平狀態(tài)直至實驗結(jié)束。KK小鼠最高可達(dá)60ng/mL，是db/db小鼠最高值的3倍。

實驗動物臟器重量和臟器系數(shù)是鑒定動物遺傳品質(zhì)的重要依據(jù)［7］。本研究得出兩種糖尿病模型小鼠所有臟器及脂肪重量均明顯大于對照組，db/db小鼠的脂肪含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過KK小鼠，而部分臟器則出現(xiàn)情況不等的萎縮癥狀，如db/db小鼠脾臟和胰腺的萎縮程度大于KK小鼠，而KK小鼠肝臟的萎縮程度則大于db/db小鼠，以上癥狀均說明這兩種糖尿病模型各自會影響免疫系統(tǒng)功能如脾臟，以及肝臟和胰腺的功能。

本實驗也得出KK小鼠和db/db小鼠會出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞脂肪變性、蛋白管型，腎間質(zhì)組織充血、水腫，炎性細(xì)胞浸潤等腎臟病變，可引發(fā)糖尿病腎病，與報道相符，如Ninichuk等［8］報道db/db小鼠在晚期會出現(xiàn)嚴(yán)重的腎臟病變、蛋白尿，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)腺皮質(zhì)線粒體變形、脂滴減少、細(xì)胞核變形、染色質(zhì)邊集等異常病變；王謙等［9］對28周齡KK-Ay小鼠進(jìn)行病理學(xué)研究分析得出其腎臟系膜增多，腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)明顯空泡，腎間質(zhì)纖維化等系列病變。同時，實驗還得出這兩種動物模型均出現(xiàn)程度不等的肝細(xì)胞大片壞死、大量炎細(xì)胞浸潤以及纖維組織增生，且肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變性，是研究糖尿病繼發(fā)病-肝臟疾病發(fā)病機(jī)理以及肝病藥物療效的有效動物模型，與文獻(xiàn)研究基本一致，如Yu等［10］報道KK-Ay/Ta小鼠可出現(xiàn)非酒精性脂肪肝，肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞呈脂肪變形，肝組織纖維化。除此之外，Homo-Delarche［11］報道Ⅱ型糖尿病動物模型在病程早期出現(xiàn)胰島增生肥大，隨病程進(jìn)展逐漸出現(xiàn)胰島數(shù)量減少、體積縮小、β細(xì)胞調(diào)亡，提示胰島β細(xì)胞調(diào)亡是造成胰島β細(xì)胞功能受損的重要原因，引起胰島結(jié)構(gòu)破壞和功能受損，最終引起血糖控制上的惡化，而本研究也表現(xiàn)出晚期的胰島數(shù)量明顯減少、體積縮小，胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少、體積縮小，部分胰島完全萎縮、崩解，呈現(xiàn)β細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致胰島功能受損，血糖控制無力。

綜合實驗結(jié)果可以得出，KK-Ay/Ta和C57BL/KsJ-db/db小鼠均是肥胖的，伴有高血糖、高度胰島素抵抗，肝臟、腎臟病變和胰島功能不足的適用性Ⅱ型糖尿病動物模型，同時db/db小鼠早期就表現(xiàn)出血糖異常，且血糖值高、相對穩(wěn)定，雖然db/db小鼠的體重不及KK小鼠，但是db/db小鼠的脂肪含量明顯多于KK小鼠。而KK小鼠的血糖異常持續(xù)時間較長，且血清胰島素水平遠(yuǎn)大于db/db小鼠，讀者可以根據(jù)實驗需求選擇合適的糖尿病動物模型。

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