趙 璇 郭常輝

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 400010)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，臨床上一旦發(fā)生，腎臟損害常呈不可逆進(jìn)展，透析病人中DN患者占20% ～40%〔1〕，故DN的早期診斷及治療對(duì)于改善患者生活質(zhì)量及預(yù)后具有重要的臨床意義。DN的發(fā)病機(jī)制尚未明了，大量研究表明氧化應(yīng)激在DN的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。硫氧還蛋白(Trx)及Trx相互作用蛋白(TxnIP)分別參與了氧化應(yīng)激的對(duì)抗及介導(dǎo)。本文就Trx、TxnIP、氧化應(yīng)激與DN關(guān)系做一探討，旨在為DN的發(fā)病機(jī)制及治療尋求新的突破。

1 Trx

1.1 Trx的生物學(xué)特點(diǎn) Trx是一種小分子蛋白質(zhì)，分子量約為12 kD，廣泛存在于原核、真核生物中，具有氧化還原活性。它與Trx還原酶(TrxR或TR)、還原型煙酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)共同組成一個(gè)廣泛分布的NADPH依賴(lài)性二硫化物還原酶-Trx系統(tǒng)。該系統(tǒng)都包含有二硫鍵活性位點(diǎn)序列-半胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-(-Cys-Gly-Pro-Cys-)。Trx主要分為T(mén)rx-1和Trx-2兩型，Trx-l存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，Trx-2僅位于線粒體中。Powis等〔2〕通過(guò)Western印跡法證實(shí)了Trx-2的線粒體定位。目前對(duì)Trx-2功能知之甚少，本文中Trx指的是Trx-1。還原型Trx〔Trx-(SH)2〕含有巰基，氧化型Trx(Trx-S2)含有二硫鍵，后者可被TrxR、NADPH還原。Trx還原作用的機(jī)制在于其與底物X-S2結(jié)合后，在復(fù)合物的疏水環(huán)境中，Cys32的巰基作為親核物質(zhì)，與蛋白底物結(jié)合形成共價(jià)鍵的二硫化物，最后去質(zhì)子的Cys35作用于此二硫化物的二硫鍵，釋放出被還原的蛋白底物。

1.2 Trx的生物學(xué)功能 Trx的主要生物學(xué)功能在于調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，對(duì)抗氧化應(yīng)激。Trx通過(guò)多種機(jī)制對(duì)抗氧化應(yīng)激，其中主要包括兩個(gè)方面〔3〕。一方面，它作為電子載體，為生物合成的催化循環(huán)及抗氧化酶類(lèi)提供氧化還原當(dāng)量，如核糖核苷酸還原酶，蛋氨酸亞砜還原酶，及過(guò)氧化還原蛋白;另一方面，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的二硫化物的形成，Trx保護(hù)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白分子防止其聚合或者失活。

另外，Trx的還原形式可抑制凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)的活性，從而抑制ASK1依賴(lài)性的凋亡〔4〕。ASK1可激活P38MAP激酶和c-Jun N-端激酶(JNK)通道，是腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)凋亡所必需的分子物質(zhì)。Trx還具有維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、修護(hù)再灌注損傷、抑癌及細(xì)胞因子樣作用。

2 TxnIP

TxnIP〔又稱(chēng)維生素D3上調(diào)蛋白1(VDUP-1)或Trx結(jié)合蛋白2(TBP-2)〕，重約50 kD，與抑制類(lèi)蛋白具有同源性。人們最初在用1，25-二羥維生素D3治療的白血病細(xì)胞(HL-60)中發(fā)現(xiàn)了TxnIP。此后，人們用酵母雙雜交系統(tǒng)分離了TxnIP，并認(rèn)為它是Trx結(jié)合蛋白，對(duì)Trx功能及表達(dá)具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，通過(guò)抑制Trx系統(tǒng)的功能而發(fā)揮介導(dǎo)氧化應(yīng)激等作用。Patwari等〔5〕證明了TxnIP與Trx通過(guò)巰基交換形成穩(wěn)定的二硫鍵復(fù)合物而發(fā)生相互作用，并發(fā)現(xiàn)了2個(gè)對(duì)此相互作用十分重要的氨基酸基團(tuán)-TxnIP63和247位半胱氨酸殘基。

3 TRX和TxnIP與DN的關(guān)系

3.1 氧化應(yīng)激在DN的發(fā)展中起了重要作用 近年來(lái)研究表明氧化應(yīng)激在DN的發(fā)病機(jī)制中起了重要作用。Hamada等〔6〕通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病內(nèi)環(huán)境下腎臟中氧化應(yīng)激標(biāo)志物8-脫羥鳥(niǎo)苷(8-OHdG)及acrolein adduct明顯增多，提示氧化應(yīng)激參與了DN的發(fā)生發(fā)展。多種機(jī)制可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外的氧化應(yīng)激，包括糖化反應(yīng)，多元醇途徑，蛋白激酶C依賴(lài)的膜性NADPH氧化酶的活化，及線粒體內(nèi)的電子傳遞，它們介導(dǎo)了不同組織器官細(xì)胞功能的紊亂，如腎小球系膜細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。為了對(duì)抗氧化應(yīng)激，細(xì)胞擁有其自身防御機(jī)制如內(nèi)源性抗氧化劑。在細(xì)胞質(zhì)中，Trx系統(tǒng)及谷胱甘肽/谷氧還蛋白(GSH/GRX)系統(tǒng)對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡起了主導(dǎo)作用〔3〕，它們可減少細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生。已知ROS是細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，過(guò)多的ROS的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激、細(xì)胞功能的喪失、甚至細(xì)胞的凋亡，且ROS的過(guò)多產(chǎn)生與抗氧化應(yīng)激之間的失衡會(huì)導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞脂質(zhì)代謝的紊亂，引起腎小球系膜細(xì)胞的損害〔7〕。

3.2 Trx及TxnIP在腎臟中的定位與表達(dá) Dutta等〔8〕對(duì)健康小鼠的腎臟進(jìn)行Western印跡法分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在腎臟近曲小管細(xì)胞中，TxnIP主要分布于細(xì)胞核及線粒體中，少量分布于細(xì)胞質(zhì)中，在微粒體中幾乎沒(méi)有分布。電鏡下進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，TxnIP存在于腎臟近曲小管細(xì)胞的線粒體及細(xì)胞核的膜間隙中。Andvani等〔9〕通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病雌性轉(zhuǎn)基因R(TGR，mRen-2)27大鼠及DN患者腎臟中TxnIP與Trx的表達(dá)及定位。他們利用定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TxnIPmRNA在糖尿病鼠中的表達(dá)較健康對(duì)照組增多，Trx在糖尿病鼠與非糖尿病鼠中的表達(dá)卻無(wú)明顯區(qū)別;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TxnIP mRNA在大鼠腎臟的腎小管及遠(yuǎn)端腎單位中有大量表達(dá)，且TxnIP蛋白的分布與TxnIPmRNA相似;他們?cè)贒N患者中得到了與前面所述相同的結(jié)果。與TxnIP相比，大鼠腎臟中Trx基因的表達(dá)多局限于皮質(zhì)，內(nèi)側(cè)帶多于外側(cè)帶，并在皮質(zhì)所有結(jié)構(gòu)中均有表達(dá)。

3.3 TxnIP與DN 有研究稱(chēng)〔10〕，高糖環(huán)境下TxnIP的表達(dá)依賴(lài)于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)對(duì)其的上調(diào)作用，目前認(rèn)為T(mén)GF-β1為細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的核心，參與了DN腎臟肥大和硬化的發(fā)生、發(fā)展。然而Qi等〔11〕在高糖環(huán)境下培養(yǎng)人類(lèi)腎臟近曲小管細(xì)胞，他們用小分子干擾RNA(siRNA)將TGF-β1基因沉默，發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下在TGF-β1基因沉默的近曲小管細(xì)胞中，TxnIP及其啟動(dòng)子的活性仍進(jìn)一步升高，證明高糖環(huán)境誘導(dǎo)TxnIP的升高并非依賴(lài)于TGF-β1。

為了探討高糖對(duì)腎臟三種不同類(lèi)型細(xì)胞-腎小球系膜(mesangial)細(xì)胞、近曲小管細(xì)胞及遠(yuǎn)曲小管/集合管細(xì)胞 TxnIP及Trx基因表達(dá)的影響。Advani等〔9〕將三種細(xì)胞置于25 mmol/L糖水中培養(yǎng)48 h，與暴露于5.6 mmol/L的糖水中的細(xì)胞相比，TxnIP在腎小球近曲小管、遠(yuǎn)曲小管及集合管細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加，Trx mRNA在腎小球系膜細(xì)胞及遠(yuǎn)曲小管/集合管細(xì)胞中表達(dá)下降，在近曲小管細(xì)胞中無(wú)明顯影響;胰島素二硫化物還原分析顯示，暴露于高糖環(huán)境下48 h后Trx的生物活性下降了;他們又用siRNA沉默TxnIP基因，培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞及近曲小管細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)該環(huán)境下高糖對(duì)Trx活性的影響減弱了。此實(shí)驗(yàn)揭示了高糖對(duì)三種細(xì)胞TxnIP及Trx基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步證明了TxnIP是Trx活性的負(fù)性調(diào)節(jié)劑。

有研究提示腎小球系膜細(xì)胞的病理改變?cè)贒N的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。持續(xù)的TxnIP超表達(dá)可增加高糖及葡糖胺介導(dǎo)的腎小球系膜外基質(zhì)基因表達(dá)及氧化應(yīng)激，引起腎小球系膜細(xì)胞的損害，促進(jìn)DN的進(jìn)展。Kobayashi等〔12〕通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了TxnIP可導(dǎo)致膠原蛋白在腎小球系膜細(xì)胞的沉積。腸促胰島素肽(EX-4)為長(zhǎng)效的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動(dòng)劑，可以降低TxnIP在胰島β細(xì)胞中的水平;Shao等〔13〕研究表明EX-4-cAMP信號(hào)通路可導(dǎo)致蛋白酶體依賴(lài)性的TxnIP降解，保護(hù)DN患者胰島β細(xì)胞，促進(jìn)胰島素分泌，降低其血糖水平，改善腎臟所處的內(nèi)環(huán)境。

Hamada等〔6〕利用STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠來(lái)研究TxnIP在DN發(fā)病機(jī)制中可能存在的作用。為了評(píng)估實(shí)驗(yàn)組與健康對(duì)照組大鼠腎臟中氧化應(yīng)激程度的差別，他們利用酶聯(lián)免疫分析方法檢測(cè)大鼠腎臟中氧化應(yīng)激標(biāo)志物8-OHdG與acrolein adduct的水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中兩種標(biāo)志物明顯升高;利用QRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟中TxnIP mRNA的表達(dá)也高于對(duì)照組。既然TxnIP可以與Trx相互作用，該實(shí)驗(yàn)證明了糖尿病內(nèi)環(huán)境促進(jìn)了TxnIP與Trx的相互作用，抑制Trx的抗氧化應(yīng)激功能，引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的增加，提示TxnIP可能是糖尿病內(nèi)環(huán)境下氧化應(yīng)激保持高水平的機(jī)制。

3.4 Trx超表達(dá)抑制DN的進(jìn)展 近年來(lái)研究證實(shí)凋亡可導(dǎo)致自身免疫性及藥物性糖尿病胰島β細(xì)胞的損害，ROS的細(xì)胞毒性可損害1型糖尿病患者的胰島β細(xì)胞。Hotta等〔14〕通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Trx可保護(hù)胰島β細(xì)胞，減少凋亡與氧化應(yīng)激對(duì)它的損害;Trx在胰腺細(xì)胞中的超表達(dá)可減少1型糖尿病的發(fā)生。

Hamada等〔15〕對(duì)8 w大的雄性Trx轉(zhuǎn)基因鼠(Trx-Tg)與野生型同窩鼠(WT)分別給予鏈脲佐菌素或檸檬酸鹽載體喂養(yǎng)。24 w后，通過(guò)對(duì)四組小鼠血液及尿液的生化分析及腎臟的組織學(xué)分析，來(lái)評(píng)估氧化應(yīng)激與糖尿病腎病的腎臟損害程度。結(jié)果顯示:糖化血紅蛋白(HbA1c)水平在糖尿病Trx-Tg與糖尿病WT之間并無(wú)顯著差別;而糖尿病Trx-Tg中尿蛋白的排泄卻明顯低于糖尿病WT;與糖尿病WT相比，糖尿病Trx-Tg中TGF-β的表達(dá)顯著下降，腎小球系膜基質(zhì)膨脹和腎小管損傷均被抑制;同時(shí)，糖尿病Trx-Tg尿中氧化應(yīng)激標(biāo)志物8-OHdG與acrolein adduct的排泄低于對(duì)照組，且它們?cè)谀I臟中的免疫染色強(qiáng)度也弱于糖尿病WT，通過(guò)Trx的超標(biāo)達(dá)全身及腎臟的氧化應(yīng)激減弱了。這個(gè)實(shí)驗(yàn)提示氧化應(yīng)激與DN進(jìn)展的相關(guān)性以及Trx抑制DN進(jìn)展的潛在可能性。

4 展望

作為內(nèi)源性氧化應(yīng)激抑制劑，Trx的超標(biāo)可能對(duì)于DN的進(jìn)展具有抑制作用。最新研究顯示，Trx可保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受藥物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損害〔16〕，同時(shí)Trx的超標(biāo)達(dá)可通過(guò)抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡，對(duì)糖尿病鼠的胚胎具有保護(hù)作用〔17〕。相反，TxnIP的過(guò)度表達(dá)介導(dǎo)了氧化應(yīng)激，造成相應(yīng)組織器官的損害。Trx、TxnIP、氧化應(yīng)激與DN之間關(guān)系的研究為DN的發(fā)病機(jī)制及治療提供了一個(gè)新思路，沉默TxnIP基因、開(kāi)發(fā)TxnIP抑制劑或Trx激動(dòng)劑可能成為未來(lái)DN治療中新的切入點(diǎn)。

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