韓 威 孫立忠 胡林森 (吉林省腦科醫(yī)院神經內科，吉林 四平 36000)

魚藤酮與帕金森病

韓 威 孫立忠 胡林森1(吉林省腦科醫(yī)院神經內科，吉林 四平 136000)

魚藤酮;帕金森病

帕金森病(PD)是一種常見的影響中老年人運動功能的中樞神經系統(tǒng)慢性變性疾病。臨床表現為靜止性震顫、肌僵直、運動遲緩和姿勢步態(tài)異常等。病理特征為黑質多巴胺(DA)能神經元缺失、殘存神經元內出現路易小體(LB)。至今散發(fā)性PD的病因不清。流行病學調查提示環(huán)境因素中的殺蟲劑接觸可能是PD潛在的危險因素，經常接觸農藥的人群PD患病率明顯高于非暴露人群。魚藤酮作為一種自然存在的化合物，自20世紀40年代以來一直是最廣泛應用于農業(yè)除害和魚塘清理的殺蟲劑。近年來的研究發(fā)現，魚藤酮可能對機體神經系統(tǒng)的功能產生影響，尤其是與PD之間可能存在潛在聯系。

1 魚藤酮的生物學特性

魚藤酮是從醉魚豆屬植物毛魚藤的根和葉的液汁魚藤膠中分離出的主要化學成分?；瘜W名稱為 2R-(2，6aa，12aa)-1，2，12，12a-四氫-8，9-二甲氧基-2-(1-甲基乙烯基)-〔I〕-苯并吡喃〔3，4-b〕-呋喃并-〔2，3-h〕-苯并吡喃-6(6aH)-酮。魚藤酮脂溶性很強，對血腦屏障有較好的穿透能力，很容易通過生物膜，不需要依賴多巴胺轉運體就可以直接進入胞質內，并選擇性地聚集在線粒體等細胞器，抑制復合體I活性，損害氧化磷酸化，發(fā)揮細胞毒作用。

2 魚藤酮與PD的相關性

以人群為基礎的病例-對照研究發(fā)現，田間勞動和殺蟲劑的使用是PD的危險因素，且田間勞動的時間長短與危險程度呈劑量-效應關系。研究工作進一步發(fā)現，在控制可能的混雜因素后殺蟲劑使用是唯一的危險因素，暴露于殺蟲劑后患PD的危險性大大增加了。在動物實驗方面，Betarbet等〔1〕通過頸靜脈插管灌注魚藤酮，在大鼠復制出類似PD的模型。病理檢查發(fā)現黑質DA能神經元有明顯的退行性變，神經細胞內出現LB樣包涵體，動物出現震顫、步態(tài)不穩(wěn)等癥狀。此后，Alam等〔2〕人給SD大鼠腹腔注射1.5 mg/kg(低劑量)和2.5 mg/kg(中劑量)的魚藤酮，2個月后兩組動物均出現劑量依賴性的僵直癥狀，在紋狀體后部和額前皮質發(fā)現DA能神經細胞突起的明顯減少和DA耗竭。Sherer等〔3〕采用皮下注射魚藤酮的方法，到路易鼠出現行為異常時，在黑質部位檢測到了特異性的選擇性的DA能神經元變性缺失。同樣，Hoglinger等〔4〕給雄性路易鼠的股靜脈內注入2.5 mg·kg-1·d-1魚藤酮，28 d后也觀察到黑質紋狀體DA能神經通路變性。馮媛和趙喜林等〔5，6〕應用改良的魚藤酮注射方法，先后成功地建立了動物的PD模型，為PD的病理研究和新藥物的臨床前篩選提供了新途徑。魚藤酮誘導的PD動物模型是一個比較成功的環(huán)境毒素的PD模型。主要優(yōu)點是:①在大鼠中，該模型涵蓋了與人類PD相似的所有標志特征。②魚藤酮誘導DA能神經元死亡伴隨有LB樣包涵體形成，這種包涵體在MPTP模型中難以見到，在6-羥基多巴(6-OHDA)模型中不能看到。③魚藤酮對黑質紋狀體DA能通路損傷的程度在不同鼠類之間有高度變異，提示個體之間對魚藤酮反應的敏感性不同，從而反映出鼠類之間的遺傳差異，這為環(huán)境因素和遺傳因素相互作用促進PD病理機制的學說提供了新的證據。④復合體Ⅰ在全腦普遍抑制，但僅黑質DA神經元變性，這特別提示黑質DA能神經元對魚藤酮的易損傷性。這些結果提示，魚藤酮與PD可能存在病原學關系。

3 魚藤酮對DA能神經元毒性作用的機制

3.1 魚藤酮與線粒體損傷 線粒體通過氧化磷酸化產生ATP，給機體供能。參與氧化磷酸化的酶位于線粒體內膜上。復合體Ⅰ(NADH-泛醌還原酶)是電子傳遞鏈第一個酶。現已證實PD病人的黑質致密部酶復合體Ⅰ活性下降，還有研究發(fā)現PD患者的骨骼肌、血小板中的酶復合體Ⅰ活性也降低。Dawson等〔7〕的研究提示復合體Ⅰ排列紊亂可引起α-synuclein聚集，促進DA能神經元死亡。這些證據表明復合體Ⅰ功能改變在特發(fā)性PD發(fā)病機制中都起著重要作用。

魚藤酮是線粒體氧化呼吸鏈復合體Ⅰ特異性抑制劑。Seaton等〔8〕將人神經母細胞瘤株(SK-N-MC)細胞暴露于魚藤酮(0.25～1μmol/L)，顯示給藥后24～48 hATP呈劑量和時間依賴性下降。Sherer〔9〕等將 SK-N-MC細胞暴露于魚藤酮(10 nmol/L～1μmol/L)，引起ATP耗竭、氧化損傷和細胞死亡。Bonsi〔10〕從小鼠紋狀體組織中分離膽堿能神經元并使之暴露于魚藤酮，發(fā)現細胞的ATP合成功能被破壞，并進而導致Na+-K+-ATP功能下降。但是，動物實驗不能說明生物能量的缺陷直接誘導神經細胞變性，因為誘導大鼠產生PD綜合征的魚藤酮的劑量并未改變線粒體的氧耗量。Sherer等的研究提示，大鼠DA能神經元死亡可能是魚藤酮對復合體Ⅰ慢性抑制造成氧化損傷蓄積的結果。

3.2 魚藤酮與氧化應激 氧化應激參與脂質過氧化，可能促進PD的病理過程。已在PD病人的腦內找到氧化應激損傷的證據，包括腦內谷胱甘肽(GSH)水平下降、脂質過氧化增加、多巴醌生成、DNA損害等。

研究發(fā)現魚藤酮可能通過氧化應激損傷發(fā)揮其毒性作用。魚藤酮對神經細胞產生氧化損傷的證據來自于對PD動物和細胞模型的研究。魚藤酮(10～1 000 nmol/L)處理人神經母細胞瘤系(SK-N-MC)細胞，引起劑量依賴的ATP耗竭、氧化損傷和細胞死亡，而且此細胞死亡可被抗氧化劑阻斷。在確定氧化應激和神經細胞死亡相關性的研究中，維生素E可有效地阻斷魚藤酮引起的ATP耗竭和細胞死亡。另外在魚藤酮處理的大鼠慢性PD模型中，發(fā)現氧化損傷在中腦DA能神經元區(qū)域最為顯著，進一步說明魚藤酮抑制復合體Ⅰ造成氧化損傷的蓄積并最后導致細胞的死亡。實際上，產生活性氧(ROS)是魚藤酮在體內慢性抑制復合體Ⅰ的本質特征。

3.3 魚藤酮與細胞凋亡 PD病人最重要的病理特征為黑質致密部DA能神經元的缺失。凋亡、壞死和自噬均可能促進這一缺失過程。有研究表明PD病人黑質DA能神經元顯示凋亡的特征。最近，Tatton〔11〕等也在PD病人的黑質部位觀察到DA能神經元凋亡的特征性改變。這提示細胞凋亡可能是DA能神經元缺失的一種主要機制。

魚藤酮可能通過誘導細胞凋亡發(fā)揮其毒性作用。自由基清除劑等可保護DA能細胞系免于魚藤酮誘導的細胞凋亡，這提示魚藤酮通過誘導ROS的釋放來促進DA能神經元的凋亡〔12〕。在神經母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y)細胞，魚藤酮通過抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT信號途徑，提高糖原合成酶激酶3β活性，增加半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)活化，促進細胞凋亡〔13〕。將原代培養(yǎng)的E15大鼠中腦腹側的DA能神經元暴露于30 nM魚藤酮11 h后，酪氨酸羥化酶免疫染色陽性的DA能神經元的細胞數快速下降，僅有23%存活，而魚藤酮處理后的總神經元有73%存活，這提示DA能神經元對魚藤酮更加敏感〔14〕。

3.4 魚藤酮與DA Stroke等的研究提示PD患者涉及DA神經遞質的紊亂。DA既是一種腦內天然的神經遞質，又可作為外周和中樞神經系統(tǒng)去甲腎上腺素和腎上腺素合成的中間產物，參與神經功能的調節(jié)。DA自身的生化特點決定了它極易處于氧化狀態(tài)，可能是體內氧化應激的毒物〔15〕。

魚藤酮處理的PD動物和細胞模型中均顯示多DA能神經元的選擇性變性。對原代培養(yǎng)的大鼠中腦細胞的研究提示，魚藤酮的神經毒性涉及超氧自由基和內源性DA的參與。線粒體功能失調可能使DA能神經元對DA更加敏感。在魚藤酮處理的小鼠，觀察到紋狀體DA更新率提高可能導致ROS增加。Burke〔16〕的研究提示DA的代謝物是引發(fā)PD中DA能神經元缺失的關鍵性內源性毒素。這些研究結果表明，在內源性DA存在的情況下，魚藤酮誘導的超氧化物自由基可能對DA能神經元的選擇性缺失有重要作用。

3.5 魚藤酮與小膠質細胞活化 小膠質細胞是腦內巨噬細胞，受到刺激時表現出快速增值、肥大并釋放一些炎性細胞因子。黑質存在大量的小膠質細胞。已有證據表明在特發(fā)性PD病人中黑質和紋狀體中的反應性小膠質細胞是增加的。魚藤酮處理的大鼠，在黑質紋狀體多DA能神經通路明顯損傷之前，就出現顯著的OX-42免疫組化染色陽性的活化的小膠質細胞〔17〕，Gao等〔18〕在小膠質細胞和原代中腦神經元體外共培養(yǎng)的實驗中，應用低濃度的魚藤酮處理，結果有顯著的選擇性的DA能神經細胞死亡;若同時抑制小膠質細胞的NADPH氧化酶的活性，將減輕DA能神經元的死亡。

3.6 魚藤酮與興奮性氨基酸毒性作用 興奮性神經遞質谷氨酸通過NMDA受體改變細胞內鈣離子濃度造成鈣超載，可能參與神經變性。谷氨酸誘導的興奮毒性一直被認為是腦缺血和癲癇的重要發(fā)病機制，現認為它在PD發(fā)病中也可能發(fā)揮作用。谷氨酸受體大量活化導致細胞鈣離子內流增加和細胞內鈣超載，促進神經元的死亡。在MPTP誘導的大鼠和非人類靈長類動物中，應用NMDA受體拮抗劑可保護DA能神經元，這提示PD中存在谷氨酸介導的興奮毒性。魚藤酮可加強興奮性氨基酸對DA能神經元的損傷作用。但用魚藤酮預處理DA能細胞后，再用相同濃度谷氨酸培養(yǎng)DA能細胞，則見谷氨酸對DA能細胞的損傷作用明顯加強〔19〕，提示魚藤酮與興奮性氨基酸對DA能細胞有協(xié)同毒性作用。

3.7 魚藤酮與α-synuclein α-synuclein免疫組化染色陽性的LB形成是PD的病理標志。在魚藤酮處理的大鼠PD模型中可見殘存神經元內有α-synuclein陽性的包涵體形成。目前，LB形成的過程及其與神經缺失的關系尚不清楚。魚藤酮的PD模型可能成為研究LB形成的分子基礎和LB形成與DA能神經元死亡之間關系的一個有力工具。在成神經細胞瘤系SHSY5Y細胞和原代培養(yǎng)中腦神經元中加入魚藤酮可抑制線粒體復合體Ⅰ，使蛋白酶體系統(tǒng)本身發(fā)生氧化修飾，導致其降解異常蛋白能力的下降〔20〕。研究神經元變性死亡和包涵體形成之間的關系，可能為PD的病理機制提供新的見解。

1 Betarbet R，Sherer TB，MacKenzie G，etal.Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease〔J〕.Nat Neurosci，2000;3(12):1301-6.

2 Alam M，Schmidt WJ.Rotenone destroys dopaminergic neurons and induces parkinsonian symptoms in rats〔J〕.Behav Brain Res，2002;136(1):317-24.

3 Sherer TB，Kim JH，Betarbet R，et al.Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation〔J〕.Exp Neurol，2003;179(1):9-16.

4 H?glinger GU，Féger J，Prigent A，et al.Chronic systemic complex I inhibition induces a hypokineticmultisystem degeneration in rats〔J〕.JNeurochem，2003;84(3):491-502.

5 馮 媛，梁直厚，王 濤，等.魚藤酮帕金森病大鼠模型建立的研究〔J〕.卒中與神經疾病，2004;11(6):374-7.

6 趙喜林，顧振綸，秦正紅.長期低劑量皮下注射魚藤酮制作大鼠帕金森病模型〔J〕.中國藥理學通報，2005;21(10):1274-7.

7 Dawson TM，Dawson VL.Molecular pathways of neurodegeneration in parkinson's disease〔J〕.Science，2003;302(5646):819-22.

8 Seaton TA，Cooper JM，Schapira AH.Free radical scavengers protect dopaminergic cell lines from apoptosis induced by complex Iinhibitors〔J〕.Brain Res，1997;777(1-2):110-8.

9 Sherer TB，Betarbet R，Testa CM，etal.Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease〔J〕.JNeurosci，2003;23(34):10756-64.

10 Bonsi P，Calabresi P，De Persis C，et al.Early ionic and membrane potential changes caused by the pesticide rotenone in striatal cholinergic interneurons〔J〕.Exp Neurol，2004;185(1):169-81.

11 Tatton WG，Chalmers-Redman R，Brown D，et al.Apoptosis in Parkinson's disease:signals for neuronal degradation〔J〕.Ann Neurol，2003;53(3):61-70.

12 Molina-Jiménez MF，Sánchez-Reus MI，Andres D，et al.Neuroprotective effect of fraxetin and myricetin against rotenone-induced apoptosis in neuroblastoma cells〔J〕.Brain Res，2004;1009(1-2):9-16.

13 King TD，Bijur GN，Jope RS.Caspase-3 activation induced by inhibition ofmitochondrial complex I is facilitated by glycogen synthase kinase-3beta and attenuated by lithium〔J〕.Brain Res，2001;919(1):106-14.

14 Ahmadi FA，Linseman DA，Grammatopoulos TN，et al.The pesticide rotenone induces caspase-3-mediated apoptosis in ventral mesencephalic dopaminergic neurons〔J〕.JNeurochem，2003;87(4):914-21.

15 BurkeWJ，Li SW，Chung HD，etal.Neurotoxicity ofMAOmetabolites of catecholamine neurotransmitters:role in neurodegenerative diseases〔J〕.Neurotoxicology，2004;25(1-2):101-15.

16 BurkeWJ，Li SW，Williams EA，etal.3，4-Dihydroxyphenylacetaldehyde is the toxic dopamine metabolite in vivo:implications for Parkinson's disease pathogenesis〔J〕.Brain Res，2003;989(2):205-13.

17 Sherer TB，Betarbet R，Kim JH，et al.Selective microglial activation in the rat rotenonemodel of Parkinson's disease〔J〕.Neurosci Lett，2003;341(2):87-90.

18 Gao HM，Hong JS，Zhang W，et al.Distinct role for microglia in rotenone-induced degeneration of dopaminergic neurons〔J〕.J Neurosci，2002;22(3):782-90.

19 Marey-Semper I，Gelman M，Levi-Strauss M.A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation〔J〕.JNeurosci，1995;15(9):5912-8.

20 Shamoto-Nagai M，Maruyama W，Kato Y.An inhibitor ofmitochondrial complex I，rotenone，inactivates proteasome by oxidative modification and induces aggregation of oxidized proteins in SH-SY5Y cells〔J〕.J Neurosci Res，2003;74(4):589-97.

R742.5

A

1005-9202(2011)12-2376-03

1 吉林大學第一醫(yī)院神經內科

胡林森(1949-)，男，教授，博士生導師，主要從事神經變性疾病研究。

韓 威(1976-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事帕金森病的研究。

〔2008-05-06收稿 2008-11-11修回〕

(編輯 袁左鳴/曹夢園)