周竹青 易 黎 韓金玲 沈惠敏 (北京大學(xué)深圳醫(yī)院,廣東 深圳 58036)

阿爾茨海默病(AD)難以早期確診,尚缺乏靈敏、快速、準(zhǔn)確的活體診斷技術(shù),確診率較低。因此,尋求早期診斷AD,特別是應(yīng)用納米技術(shù)檢測(cè)AD易感基因,已經(jīng)成為了神經(jīng)變性疾病領(lǐng)域的研究新熱點(diǎn)和難點(diǎn)?，F(xiàn)就AD的基因研究現(xiàn)狀以及納米技術(shù)在早期診斷AD的應(yīng)用與進(jìn)展綜述于下。

1 AD的基因研究現(xiàn)狀

AD是老年人中常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病〔1〕,特征性病理變化為大腦皮層萎縮,并伴有 β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積,神經(jīng)原纖維纏結(jié),大量記憶性神經(jīng)元數(shù)目減少以及老年斑的形成。臨床上以50～60歲以后進(jìn)行性加重的智能障礙、記憶力減退、精神運(yùn)動(dòng)異常為主要癥狀〔2〕。截止2005年,全球該病患者已有兩千多萬,每年新發(fā)病例460多萬(每7秒新增1例患者)〔3〕。我國(guó)65歲以上人群遭受該病困擾的人數(shù)估算已超過600多萬〔4〕。AD是繼癌癥和心臟病后第三位花費(fèi)最大的疾病,給患者家庭和社會(huì)均帶來了極大的負(fù)擔(dān)〔5,6〕。AD可劃分為家族性和散發(fā)性,目前的治療尚無根本性進(jìn)展,多以早期預(yù)防和準(zhǔn)確診斷為主。而AD的確診,除了在患者病逝后通過大腦的病理檢查老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)這些指標(biāo)進(jìn)行疾病的回顧性診斷外,臨床上主要依靠神經(jīng)科醫(yī)師以臨床病史采集(NINCDS-ADRDA診斷標(biāo)準(zhǔn)〔7〕)和神經(jīng)心理量表測(cè)定(MMSE、ADAS-Cog〔8〕等),影像學(xué)檢查等為診斷手段,尚缺乏靈敏、快速、準(zhǔn)確的活體診斷技術(shù),因而其診斷率目前僅有 10% ～15%〔9〕。在AD眾多的可能病因中,如遺傳、環(huán)境、代謝、病毒感染等多種因素,遺傳因素是其主要原因之一。目前已知與AD相關(guān)的基因至少有50個(gè),主要分布在染色體的1、6、12、14、17、19和21號(hào),這些基因的變異頻率AD患者較正常人要高3～5倍,其中有些基因與家族性AD相關(guān),有些與散發(fā)性AD相關(guān)〔10〕。下面就AD相關(guān)的主要基因及其功能蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展展開討論。

1.1 載脂蛋白E(ApoE)基因 1973年,Shore等首次在正常人極低密度脂蛋白中發(fā)現(xiàn)ApoE。ApoE基因位于19q1312,全長(zhǎng)3.7 kb,有 4個(gè)外顯子,3個(gè)等位基因(ε 2、ε 3和 ε 4),分別編碼產(chǎn)生 E2、E3、E4三種蛋白。3個(gè)等位基因中,ε 4是目前公認(rèn)的AD危險(xiǎn)因素,與散發(fā)性AD關(guān)系密切。ε 4與40%～50%的早發(fā)性AD及80%的遲發(fā)性AD相關(guān),并與AD發(fā)病率呈劑量-依賴性關(guān)系,可使AD發(fā)病年齡提前;而 ε 2和 ε 3可使 AD發(fā)病率降低,發(fā)病年齡延遲,是一種保護(hù)性因素。其機(jī)制可能是ε 4等位基因與淀粉樣前體蛋白(APP)基因間相互作用,影響其水解位點(diǎn),增加 Aβ沉積,導(dǎo)致早老素(SP)發(fā)生和膽堿不足。ApoE3和ApoE4與Tau蛋白間存在相互作用,ApoE3可與Tau蛋白形成耐受十二磺基磺酸鈉的復(fù)合物,ApoE4則不能。這提示ApoE3可結(jié)合并調(diào)節(jié)Tau蛋白的磷酸化,促進(jìn)微管蛋白裝配;而ApoE4的作用正好相反。遲發(fā)性 AD伴ApoEε 4等位基因患者的腦組織中,其Aβ沉積高于遲發(fā)性AD未伴 ApoEε 4等位基因患者;提示ApoEε 4等位基因是個(gè)體發(fā)生AD的危險(xiǎn)因素,在AD發(fā)生發(fā)展中起重要作用。另外,Persson〔11〕等發(fā)現(xiàn)在AD發(fā)病以前,ApoEε 4的存在可影響顯微鏡下胼胝體白質(zhì)的完整性。Trittmatter〔12〕研究證實(shí),在 AD患者的腦脊液中發(fā)現(xiàn)ApoE與Aβ可高度結(jié)合,因此推測(cè)ApoE在患者SP的形成中有分子伴娘作用,參與調(diào)節(jié)淀粉樣蛋白的形成。由于 AD的ApoE4升高具有較高的特異性,ε 4等位基因與AD發(fā)病有關(guān),是散發(fā)性AD最重要的危險(xiǎn)因子,因此建議將其列入AD的基因診斷標(biāo)志。

1.2 淀粉樣前體蛋白(APP)基因 APP基因位于21號(hào)染色體,長(zhǎng)約300 kb,由19個(gè)外顯子組成,與 AD緊密連鎖,是最早發(fā)現(xiàn)與AD相關(guān)的突變基因,為常染色體顯性遺傳,與家族性早發(fā)型 AD有著密切關(guān)系。正常生理?xiàng)l件下,多數(shù) APP由 α-分泌酶裂解成可溶性 β-APP釋放到神經(jīng)元外,β-APP被 γ-分泌酶裂解,極少部分 β-APP在胞質(zhì)經(jīng)溶酶體內(nèi)的 β-和 γ-分泌酶作用裂解為 Aβ〔13,14〕。當(dāng)APP基因發(fā)生突變時(shí),突變的APP產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn),易被 β-分泌酶水解,并在 γ-分泌酶作用下形成游離 Aβ;Aβ越長(zhǎng),毒性作用越強(qiáng),這是因?yàn)樗芫奂礁嗟腁β,裝配成不溶性的共聚體沉淀,這是Aβ神經(jīng)毒性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。聚集的Aβ形成不可逆沉淀,最終導(dǎo)致 SP形成,從而引起AD。AD的發(fā)生與APP基因的過度表達(dá)以及經(jīng) β-和 γ-分泌酶產(chǎn)生的Aβ在腦內(nèi)堆積和沉淀有關(guān)。Aβ是各種因素誘發(fā)AD的共同通路,是 AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。Hardy〔15〕等提出的淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說認(rèn)為,Aβ在大腦皮層堆積是AD病理發(fā)生的早期關(guān)鍵事件,最終導(dǎo)致AD其他的病理變化。

1.3 Tau蛋白基因 Tau蛋白基因位于17號(hào)染色體,在種系間高度保守,Tau蛋白是其表達(dá)產(chǎn)物,主要分布于人類大腦額葉、顳葉、海馬及內(nèi)嗅區(qū)等部位,是體內(nèi)含量最高的微管相關(guān)蛋白。目前,在成人腦組織中發(fā)現(xiàn)6種Tau蛋白異構(gòu)體,其相對(duì)分子質(zhì)量為48 000～67 000,有352～441個(gè)氨基酸。AD患者腦中Tau蛋白發(fā)生異常修飾,過度磷酸化,隨之聚集成雙螺旋纖維絲形式(PHFs),喪失了促進(jìn)微管組裝的生物活性,故導(dǎo)致細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)異常和神經(jīng)細(xì)胞死亡〔16〕。AD患者部分過度磷酸化Tau蛋白是可溶的,另一部分沉積在PHFs中為不可溶的,稱為PHF-Tau。PHF-Tau沉積于腦中可致神經(jīng)元變性。

1.4 早老素1(PS-1)和早老素2(PS-2)基因 PS基因是目前發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)與AD發(fā)病密切相關(guān)的基因。PS占家族性AD致病基因的30%～50%,占早發(fā)型 AD致病基因的70% ～80%。PS-1和 PS-2基因分別定位于14和1號(hào)染色體,即14q24.3和1q41.2,長(zhǎng)約75和90 kb。PS-1和PS-2屬進(jìn)化保守基因家族成員,其疏水外型是具有大量跨膜區(qū)域的整合膜蛋白,基因產(chǎn)物位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,提示PS可能在分泌通路上調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和合成。PS-1或PS-2突變基因患者Aβ42升高可能由于PS-1或PS-2蛋白質(zhì)功能異常所致。迄今已發(fā)現(xiàn)至少37種PS-1基因突變與早發(fā)性AD有關(guān)〔17〕。一定條件下,PS-1基因突變細(xì)胞選擇性地導(dǎo)致纖維原性較強(qiáng)的、易聚集的Aβ42產(chǎn)生過多,從而導(dǎo)致AD發(fā)生。PS-1基因缺陷可通過抑制β-APP的 γ-分泌酶發(fā)生裂解,減少 β-APP形成。另外,PS-1基因突變還可引起Tau蛋白等細(xì)胞骨架蛋白之間的相互作用異常,破壞離子通道的微結(jié)構(gòu),影響細(xì)胞內(nèi)外離子交換,引起AD病理改變。突變的PS-2基因表達(dá)產(chǎn)物可通過對(duì)C末端肽水解酶的影響而作用于APP的水解過程,使聚集性Aβ產(chǎn)生增多而發(fā)生沉積,形成SP,協(xié)助Aβ升高細(xì)胞內(nèi)鈣,加重氧自由基產(chǎn)生,促進(jìn)線粒體膜電位下降,從而引起細(xì)胞凋亡。梁平〔18〕等研究結(jié)果表明突變型PS-1(M146L)導(dǎo)致 Aβ1-42的分泌增加,提示PS-1有可能作為預(yù)期的 γ-分泌酶參與APP分解生成 Aβ的過程。也有人認(rèn)為PS是一種 γ-分泌酶的協(xié)同因子或 γ-分泌酶通路中的協(xié)調(diào)物〔19〕。 De Strooper〔20〕則提出,PS-1 與 PS-2 可能是γ-分泌酶催化亞基。因此 PS對(duì) APP代謝過程是如何作用的尚有待研究。以上是對(duì)AD主要相關(guān)基因Apo E、APP、PS-1和PS-2等位基因的研究現(xiàn)狀的總結(jié),那么如何早期檢測(cè)這些AD相關(guān)基因,尤其應(yīng)用高新技術(shù)靈敏高效地檢測(cè)AD致病基因？

2 納米技術(shù)在早期檢測(cè)AD患者基因的應(yīng)用與前景

檢測(cè)基因的方法,目前診斷醫(yī)學(xué)主要有放射性核素和熒光分析法。其中熒光分析法因其操作程序簡(jiǎn)便,觀測(cè)安全而較受重視。但是,傳統(tǒng)的熒光染料具有一定的缺陷:易光漂白和光解,故檢測(cè)的特異性較低;觀測(cè)時(shí)間極短。而放射性核素的檢測(cè)方法雖有高靈敏度的優(yōu)越性,但因其對(duì)環(huán)境的高污染危害而漸趨淘汰。目前研究的納米技術(shù)既有靈敏度和特異性高的優(yōu)點(diǎn),又彌補(bǔ)了上述方法的缺陷,可用于檢測(cè)AD的易感基因,詳述如下。

2.1 應(yīng)用納米晶體標(biāo)記探針檢測(cè)散發(fā)性AD的ApoEε 4基因

目前已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種基因如 APP、PS1、PS2、ApoEε 4、A2M、LRP1、TNF、ACE、MTHFR 和 mtDNA 等與 AD 相關(guān)〔21〕。近年來,發(fā)病率更高的散發(fā)性AD受到較多的關(guān)注。ApoEε 4等位基因是ApoE主要基因型之一,其第4號(hào)外顯子上有2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異。ApoEε 4等位基因與AD發(fā)病有關(guān),是散發(fā)性 AD最重要的危險(xiǎn)因子。確定ApoE基因型有助于臨床篩查和早期診斷大部分相關(guān)患者,篩查需要進(jìn)行干預(yù)治療的人群。

楊華靜等〔22〕應(yīng)用熒光半導(dǎo)體納米晶體與ApoEε 4等位基因特異性寡核苷酸反應(yīng)合成探針,來檢測(cè)AD陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本的ApoE的基因型,得出新型熒光探針檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)本基因型一致的結(jié)論,并大膽推測(cè)熒光半導(dǎo)體納米晶體標(biāo)記探針將替代傳統(tǒng)方法,有望成為一種有效可靠的早期篩選AD的方法。這種新型材料熒光半導(dǎo)體納米晶體,標(biāo)記寡核苷酸探針,用于檢測(cè) ApoEε 4等位基因,具有靈敏度和特異性高的優(yōu)點(diǎn),熒光檢測(cè)時(shí)間窗長(zhǎng)達(dá)數(shù)天,其無毒無害的特點(diǎn)相對(duì)于目前臨床上應(yīng)用的放射性核素,具有更大的優(yōu)越性〔23,24〕。

2.2 應(yīng)用納米磁珠技術(shù)早期檢測(cè)家族性AD患者APP基因研究表明〔15,25〕,APP基因突變可能是導(dǎo)致具有遺傳異質(zhì)性的家族性AD(FAD)的重要病因之一。FAD患者的21號(hào)染色體上APP基因第670和671位氨基酸密碼子存在突變,揭示了APP基因突變可能是導(dǎo)致FAD患者腦內(nèi)Aβ過量沉積的關(guān)鍵原因。Aβ是構(gòu)成FAD特征性的病理改變之老年斑的核心成分,同時(shí)也被認(rèn)為是FAD最重要的致病物質(zhì)之一。因此準(zhǔn)確檢測(cè)APP基因型有助于早期篩查FAD,對(duì)該疾病的防治有著重大的社會(huì)意義。納米顆粒(Nano particles)被譽(yù)為21世紀(jì)的新材料,其概念在20世紀(jì)中葉被科學(xué)界提出后得到了廣泛重視和深入的發(fā)展。納米顆粒尺度一般為1～100 nm,介于原子簇與一般微粒子之間。其所具有的量子效應(yīng),表面效應(yīng)與協(xié)同效應(yīng)使其展現(xiàn)出許多特有的性質(zhì),如比表面積大,表面活性中心多,毒性低且不易受體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)各種降解的影響。隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展,納米顆粒逐漸被應(yīng)用到細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。尤其是納米磁珠(MNP)在醫(yī)學(xué)病原微生物檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用,充分顯示了其良好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。

我們擬應(yīng)用納米磁珠與APP等位基因相對(duì)應(yīng)的特異性寡核苷酸互補(bǔ)形成納米芯片探針,結(jié)合該目標(biāo)單鏈寡核苷酸,特異、高效、快速富集受檢者口腔拭子標(biāo)本中APP基因的痕量DNA(可低于105,稱低拷貝模板),結(jié)合后續(xù)PCR等檢測(cè)技術(shù),為早期全面準(zhǔn)確基因篩查FAD患者,提供一種新型高靈敏度,簡(jiǎn)易快速,特異性的基因診斷技術(shù)。納米芯片探針一旦研發(fā)成功在大規(guī)模人群中篩查推廣使用,可具有重大社會(huì)意義。

3 總結(jié)與展望

隨著對(duì)AD相關(guān)基因及其蛋白質(zhì)研究的深入,以及越來越多與AD相關(guān)新基因及其功能蛋白質(zhì)的不斷發(fā)現(xiàn),已知的與AD相關(guān)基因新的突變位點(diǎn)和所表達(dá)的蛋白功能也會(huì)越來越清晰。隨著各種基因和蛋白質(zhì)研究技術(shù)的不斷發(fā)展,將會(huì)在基因和蛋白水平上探討AD的發(fā)病機(jī)制并找到一條早期診斷AD的途徑,進(jìn)而采取有效的治療措施。

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