何海蓉，王正春，劉文峰，劉玉云，張勇強

(1.中國牧工商集團總公司研究院，北京 100070；2.乾元浩生物股份有限公司，北京 100070)

隨著我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖水平不斷提高，對于高品質(zhì)疫苗的需求日益增加，促使我國獸用生物制品行業(yè)迅猛發(fā)展，獸用生物制品企業(yè)數(shù)量不斷增加，在所有獸用生物制品企業(yè)跨過農(nóng)業(yè)部GMP門檻后，產(chǎn)品品質(zhì)的提升成為企業(yè)關(guān)注的重點。近年來，禽用活疫苗污染REV、ALV等蛋傳外源病毒的現(xiàn)象時有發(fā)生，企業(yè)在進行疫苗外源病毒質(zhì)量控制的過程中逐漸將關(guān)注點聚焦到制備禽用活疫苗的主要原材料SPF種蛋的純凈性方面。對于SPF雞的微生物質(zhì)量控制，世界各國根據(jù)不同國情都制訂了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。

1 SPF雞的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1.1 國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)

SPF雞是指飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)或隔離系統(tǒng)等可控環(huán)境中，無國內(nèi)外(尤其是國內(nèi))流行的雞主要傳染病，具有良好的生長和繁殖性能的雞群。根據(jù)疫病的流行情況、危害程度、控制難度及檢測水平，不同國家在不同時期對特定病原的含義(即SPF雞的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))也在不斷的發(fā)展和完善，如SPAFAS公司最初只檢測9個項目，而目前最多檢測31個項目。

國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局1999年11月10日頒布中國SPF雞國家標(biāo)準(zhǔn)，并從2000年4月1日起實施(該標(biāo)準(zhǔn)2008年修訂，2009年5月1日起實施修訂版)，標(biāo)準(zhǔn)共 10個，即 GB/T 17998-2008、GB/T 17999.1-2008、GB/T 17999.2-2008、GB/T 17999.3-2008、GB/T 17999.4-2008、GB/T 17999.5-2008、GB/T 17999.6-2008、 GB/T 17999.7-2008、 GB/T 17999.8-2008、GB/T 17999.9-2008)，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：我國SPF雞應(yīng)不含19種病原微生物，包括禽腺病毒、產(chǎn)蛋下降綜合癥、禽腦脊髓炎病毒、禽流感病毒、多殺性巴氏桿菌、禽呼腸孤病毒、禽白血病、禽貧血病毒、雞痘病毒、雞副嗜血桿菌、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞馬立克氏病病毒、雞敗血支原體、雞滑液囊支原體、雞新城疫病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、雞白痢沙門氏菌。

國外主要控制16種病原微生物，即1種細菌(雞白痢沙門氏菌)，2種支原體(雞敗血支原體、雞滑液囊支原體)和13種病毒(禽腺病毒、產(chǎn)蛋下降綜合癥、禽腦脊髓炎病毒、禽流感病毒、禽呼腸孤病毒、禽白血病、雞痘病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞馬立克氏病病毒、雞新城疫病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒)［1］。

SPF雞的微生物控制種類，沒有國際統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，但有國際共識，每個國家根據(jù)自己的實際情況確定需要控制的病原微生物種類。各國標(biāo)準(zhǔn)不僅數(shù)量不同(美國21種、法國16種、日本22種、澳大利亞16種、歐洲19種)，而且檢測項目也不完全一致。目前國際上公認的標(biāo)準(zhǔn)是 USDA和歐洲藥典(EPC)。我國的SPF雞微生物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要是參照美、日、澳的標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合我國雞病流行的實際情況而制定的，從疫病監(jiān)測的項目來看，介于美國SPAFAS公司的標(biāo)準(zhǔn)蛋和保險蛋之間，從疫病檢測的微生物種類來看，中國的SPF雞微生物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已完全接近國際水平。

1.2 我們的看法

中國的SPF雞國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定不含19種病原微生物，2010版《中國獸藥典》(三部)附錄《外源病毒檢驗法》規(guī)定，采用雞檢驗法檢測的病毒血清抗體有12種，可以看出現(xiàn)行的SPF雞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該能夠滿足活疫苗純凈性和檢驗動物易感性的要求。但從我們檢測國內(nèi)SPF種蛋情況看，部分SPF雞場提供的SPF種蛋出現(xiàn)禽呼腸孤病毒、禽腦脊髓炎病毒、雞白痢沙門氏菌卵黃抗體陽性。說明盡管有與國際接軌的SPF雞微生物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，但SPF雞微生物控制實際狀況并不樂觀。這就迫使獸用生物制品企業(yè)去研究檢測SPF種蛋中病毒卵黃抗體的方法來監(jiān)測SPF種蛋質(zhì)量。另國外盡管存在禽貧血病毒(CAV)感染現(xiàn)象，但是美國、法國等一些國家未將其列入國標(biāo)，而是單列，例如美國和歐盟允許雞場根據(jù)實際情況，提出自己的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。如美國SPAFAS公司將SPF種蛋分為三個等級：標(biāo)準(zhǔn)蛋、保險蛋和研究蛋。標(biāo)準(zhǔn)蛋(standard egg)檢測21個項目，主要用于美國國內(nèi)疫苗的生產(chǎn)；保險蛋(prem ium egg)檢測28個項目，主要用于出口；研究蛋(research egg)檢測31個項目，主要用于特殊疫病的科學(xué)研究［2］，這樣也提示在中國是否可以根據(jù)SPF雞不同用途單列一些檢測項目達到既降低檢測成本又具有標(biāo)準(zhǔn)的實際可操作性。

1.3 建議

1.3.1 鑒于SPF雞檢測種類越多，成本越高，參照發(fā)達國家的做法，建立切實可行的針對SPF雞的最低國家標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)不同的使用對象，提出不同的檢測標(biāo)準(zhǔn)和要求。

1.3.2 對SPF種蛋實行分級制度，滿足不同層次SPF種蛋的需求。在簽訂 SPF種蛋供應(yīng)合同時，明確列出 SPF種蛋控制的病原微生物種類及檢測方法和結(jié)果，讓使用者心中有數(shù)；

1.3.3 建立SPF種蛋質(zhì)量控制行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，可以先從市場反應(yīng)較大，嚴(yán)重威脅禽用活疫苗安全性的主要蛋傳病毒REV、ALV、REO、CAV等入手，建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)及監(jiān)督運行機制，通過獸用生物制品企業(yè)的原材料質(zhì)量控制手段對SPF雞場提供的SPF雞及種蛋進行監(jiān)控。

2 SPF雞檢測

2.1 檢測時間與方法

從理論上講SPF雞群被病原微生物污染的可能性隨時存在。需要每天都監(jiān)測才能保證原則上認可的質(zhì)量控制，但這在實際操作中是不可能做到的?，F(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的監(jiān)測周期是根據(jù)經(jīng)濟成本、病原微生物感染擴散所需要的時間、容易檢出的最佳時間、在SPF雞微生物控制中的重要性等諸多方面因素綜合確定的。［3］SPF雞場也會根據(jù)各自實際情況制定高于國家標(biāo)準(zhǔn)的監(jiān)測周期，特別對于REV、ALV、REO、CAV等幾種主要蛋傳微生物的檢測。

我國標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：開產(chǎn)前進行100%取樣檢測，產(chǎn)蛋期，每隔4～8周，按照雞群數(shù)量的5% ～15%抽樣，檢測國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的所有項目。

SPF雞微生物檢測方法多采用血清學(xué)方法進行，主要是因為：雞的血清學(xué)檢測方法簡單，容易進行，準(zhǔn)確性高。SPF雞微生物檢測方法有近10種，最常用的有：瓊脂擴散試驗(AGP)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、血清中和試驗(SN)、血凝抑制試驗(HI)、平板凝集試驗(SPA)等［2］。

我們比較了中國與美國、日本、澳大利亞、法國等國家的檢測項目，基本一致。血清學(xué)方法在特異性上應(yīng)該有保證，但在靈敏度方面較之病原的直接分離有差別，但因為特異性遠較靈敏性重要，假陽性的存在嚴(yán)重干擾對SPF雞群的質(zhì)量認定，所以血清學(xué)檢測成為國家標(biāo)準(zhǔn)首選的檢測方法，也為SPF雞場所接受。

2.2 我們的看法

從獸用生物制品企業(yè)的角度，我們認為血清學(xué)抗體檢測的目的最終為SPF雞是否污染微生物提供依據(jù)，而我們最關(guān)注的是SPF種蛋是否直接攜帶病原微生物，因此對于養(yǎng)殖業(yè)危害比較大、影響活疫苗純凈性的主要病原微生物，僅僅采用血清學(xué)檢測方法來判斷SPF雞的微生物攜帶狀況是不夠的，應(yīng)采取定期棉拭子采樣、病毒分離的方法來提高針對SPF雞攜帶病原微生物的檢測靈敏度。目前還沒有國家指定的SPF雞權(quán)威檢測機構(gòu)，由于檢測試劑的缺乏，能夠按照國標(biāo)進行檢測的雞場也只有少數(shù)幾家，而且都是自檢，各個雞場的檢測項目、檢測試劑、檢測方法、檢測周期也不一致［4］。部分 SPF雞場檢測項目少，檢測頻率低，甚至有的不具備檢測能力，只好委托代檢。而由于 SPF雞場的管理要求及屏障系統(tǒng)導(dǎo)致采樣困難等因素，第三方檢測機構(gòu)的監(jiān)督檢驗缺失。以上因素致使SPF雞及種蛋質(zhì)量良莠不齊，對獸用生物制品的生產(chǎn)和檢驗構(gòu)成威脅。

2.3 建議

2.3.1 盡快建立我國 SPF雞權(quán)威檢測機構(gòu)，按照SPF雞國家標(biāo)準(zhǔn)，不定期地對全國 SPF雞場進行質(zhì)量抽檢，抽樣應(yīng)具體到雞舍，既要抽檢血清 ，也要抽檢種蛋，定期公布抽檢結(jié)果，確保SPF雞胚的質(zhì)量。SPF雞場售出的SPF種蛋，要附有權(quán)威檢測單位提供的檢驗報告；

2.3.2 針對網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒、禽白血病毒、禽呼腸孤病毒、禽腦脊髓炎病毒、雞白痢沙門氏菌等垂直傳播的重點病原微生物，組織高校、科研單位及獸用生物制品企業(yè)聯(lián)合研制針對病原檢測的快速方法，并制定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，提高 SPF雞微生物檢測的靈敏度；

2.3.3 加快SPF雞微生物檢測試劑和標(biāo)準(zhǔn)品的研制和供應(yīng)，研究國產(chǎn)替代品，解決檢測試劑、標(biāo)準(zhǔn)品完全依賴進口的問題；

2.3.4 根據(jù)乾元浩南京SPF雞場的檢測實踐，建議制定高于國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測周期和抽樣量，1月齡、2月齡和3月齡按照雞群數(shù)量的5%取樣預(yù)檢，4月齡對備用雞群的每一只雞采集血樣進行100%檢測，100%檢測以后，每周按照雞群的1%抽檢進行血清學(xué)檢測，每月按照雞群的5%抽檢血檢，除周檢檢測部分重點監(jiān)控項目(從19個檢測項目中挑選數(shù)個)外，其余都檢測19個項目，周檢可以由自己完成，但是月檢和100%檢測，必須向國家指定檢測單位按照雞群數(shù)量的2%提供血樣。

3 國內(nèi)SPF種蛋的來源及供應(yīng)情況

3.1 現(xiàn)狀

1959年美國農(nóng)業(yè)部地區(qū)家禽研究所建立全球第一個SPF雞群，1961年世界上第一家商業(yè)性SPF雞生產(chǎn)企業(yè)—美國SPAFAS公司成立，1961年英國Houghton家禽研究所建立SPF雞群(ALV FREE)，七十年代荷蘭INTERVET、法國MERIEUX、澳大利亞CSIRO、日本相繼建立了SPF雞群。目前世界上生產(chǎn)SPF種蛋的3大巨頭分別是美國 SPAFAS公司，美國SUNRISE公司和德國LOHMANN公司。美國SPAFAS公司是目前世界上最大的SPF種蛋供應(yīng)商，擁有Line22(30多年歷史)和Bx(10多年歷史)兩種品系，現(xiàn)有11個雞場，36個雞舍，每個雞舍月飼養(yǎng)4000-8000只母雞，2009年生產(chǎn)3660萬枚SPF種蛋(其中美國 Illinois供應(yīng) 2100萬枚、美國Connecticut供應(yīng) 990萬枚、歐洲 Hungary供應(yīng) 570萬枚)，銷往全球40多個國家。

我國SPF雞群的飼養(yǎng)，開始于20世紀(jì)80年代。山東省家禽研究所1984年建立 SPF雞舍，1985年引進美國SPF種蛋，成功地培育出我國第一個SPF雞群。中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所1987年建立SPF雞舍，1988年引進德國羅曼公司 SPF種蛋，成功建立300只雞的SPF雞群。90年代以后，乾元浩、哈獸研、濟南斯帕法斯、遼寧益康、黑一廠等多家單位先后建立了具有一定生產(chǎn)規(guī)模的SPF雞群。

為了規(guī)范SPF雞胚生產(chǎn)，確保 SPF雞胚質(zhì)量，國家加強了對SPF雞場的管理，2007年2月發(fā)布了《獸藥生產(chǎn)、檢驗用SPF雞(蛋)定點生產(chǎn)企業(yè)管理辦法》(征求意見稿)和《獸藥生產(chǎn)、檢驗用 SPF雞(蛋)定點生產(chǎn)企業(yè)檢查驗收評定標(biāo)準(zhǔn)》，該標(biāo)準(zhǔn)共73條，全面系統(tǒng)地規(guī)范了SPF雞的飼養(yǎng)管理。

截止2009年底，全國有17家SPF雞場通過驗收，獲得SPF雞生產(chǎn)許可證，2009年共生產(chǎn)SPF種蛋2396萬枚，2010年全國又新建5家SPF雞場，從設(shè)計產(chǎn)能看基本能夠滿足供應(yīng)。

3.2 我們的看法

雖然國內(nèi)SPF雞場的數(shù)量及產(chǎn)能能夠符合要求，但SPF種源的問題沒有得到根本解決，沒有穩(wěn)定可靠的SPF種源，SPF雞場從不同途徑引進SPF種蛋，通過檢測篩選合格的SPF雞，建立自己的核心種群。這樣的狀況令國內(nèi)SPF種蛋質(zhì)量難以得到有效保證，我國每年生產(chǎn)禽用活疫苗接近1000億羽份，禽用活疫苗的純凈性已經(jīng)受到養(yǎng)殖戶的高度關(guān)注，規(guī)模化集團用戶均高價使用進口活疫苗，SPF種蛋的質(zhì)量狀況已經(jīng)成為國產(chǎn)活疫苗進入國內(nèi)中高端市場的制約因素之一，如不能有效解決SPF種源問題，國產(chǎn)禽用活疫苗的發(fā)展前景堪憂。

3.3 建議

3.3.1 SPF種源問題應(yīng)引起有關(guān)單位高度重視，近期需要通過引進國外優(yōu)質(zhì) SPF種蛋，建立國內(nèi)的SPF種蛋供應(yīng)基地來解決種源問題，中長期需要培育出中國自己的SPF種雞群，從而從根本上解決我國SPF雞的種源問題。

3.3.2 在SPF種蛋產(chǎn)大于銷的前提下，國家應(yīng)加強對SPF雞場的驗收和管理，加大對SPF雞群抽檢，建立不合格的SPF雞場淘汰機制，樹立國產(chǎn)SPF雞及種蛋的公信制，使獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)能夠選擇到優(yōu)質(zhì)SPF種蛋，養(yǎng)殖戶能夠使用放心安全的國產(chǎn)疫苗。

4 獸用生物制品企業(yè)對SPF種蛋的質(zhì)量監(jiān)測情況

4.1 現(xiàn)狀

在許多國家，通常生產(chǎn)活疫苗使用SPF種蛋，生產(chǎn)滅活苗使用非免種蛋，但是滅活劑和滅活技術(shù)不能確保殺滅所有的病原微生物，同時滅活的病毒也有可能引發(fā)免疫反應(yīng)，所以非免種蛋存在安全風(fēng)險，美國所有禽用疫苗，無論活疫苗還是滅活苗，全部使用SPF種蛋生產(chǎn)。2000年版的《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》明確規(guī)定：生產(chǎn)禽用活疫苗必須使用SPF雞胚。農(nóng)業(yè)部2006年11月22號下發(fā)的《關(guān)于加強獸用生物制品生產(chǎn)檢驗原料監(jiān)督管理的通知》規(guī)定：自2008年1月1日起，農(nóng)業(yè)部將對具備GMP資質(zhì)疫苗生產(chǎn)企業(yè)的活疫苗生產(chǎn)使用無特定病原體(SPF級)雞胚情況進行全面監(jiān)督檢查，對達不到標(biāo)準(zhǔn)要求的，將根據(jù)《獸藥管理條例》規(guī)定進行處理。

為了確保禽用活疫苗的純凈性，部分獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)建立了自己的SPF雞場，通過有效的檢測手段，控制了 SPF種蛋污染病原微生物，確保禽用活疫苗的純凈性。但多數(shù)企業(yè)并不擁有自己的SPF雞場，除了在選擇SPF雞及種蛋供應(yīng)商的初期能夠得到SPF雞血樣進行各種抗體檢測外，在使用過程中很難做到定期獲得血清監(jiān)測血清抗體，只能選擇相對穩(wěn)定的SPF種蛋供應(yīng)來源，通過對SPF種蛋卵黃抗體、疫苗半成品、成品外源微生物的檢測監(jiān)控SPF雞外源微生物污染。如針對行業(yè)關(guān)注的主要蛋傳外源微生物，企業(yè)通常采用的方法是用ELISA試劑盒檢測SPF種蛋卵黃抗體，采用PCR、間接免疫熒光等方法檢測半成品病原，采用雞胚法、細胞法、動物法檢測成品。

4.2 我們的看法

按照國家制訂并發(fā)布的SPF雞微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格執(zhí)行的SPF雞場，其種蛋質(zhì)量應(yīng)能保證無外源污染微生物，但實際上，疫苗中能夠檢測到的外源微生物絕大部分是由于SPF種蛋污染造成，這與我們SPF雞的種源、飼養(yǎng)管理、設(shè)施、質(zhì)量監(jiān)測過程中存在的問題密切相關(guān)。在 SPF雞場——獸用生

物制品生產(chǎn)企業(yè)——養(yǎng)殖戶的供應(yīng)鏈中，養(yǎng)殖戶除了國產(chǎn)活疫苗還可以選擇進口活疫苗，SPF雞場雖然真正能夠滿足19項外源微生物檢測全部合格要求的不多，但由于存在市場需求，SPF雞及種蛋仍然是供不應(yīng)求，唯有獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)面對激烈的市場競爭，根據(jù)國家和養(yǎng)殖戶要求，為保證疫苗的純凈性，不得不在疫苗原材料質(zhì)量控制及生產(chǎn)環(huán)節(jié)中建立諸多外源微生物內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，把本該SPF雞場控制的SPF種蛋外源微生物污染風(fēng)險轉(zhuǎn)嫁到獸用生物制品生產(chǎn)企業(yè)自身，無形中增加了疫苗檢測的人力、物力和財力，削弱了國產(chǎn)禽用活疫苗的國際競爭力。

4.3 建議

4.3.1 行業(yè)主管單位將企業(yè)針對 SPF種蛋及疫苗產(chǎn)品外源微生物檢測結(jié)果作為對SPF雞場進行質(zhì)量監(jiān)控的參考。同時鼓勵企業(yè)與科研單位合作將外源微生物檢測技術(shù)及企業(yè)的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)上升為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，對SPF雞場實施有效的質(zhì)量監(jiān)控；

4.3.2 建立SPF雞污染外源微生物質(zhì)量追溯機制，促使SPF雞場自覺按照國家標(biāo)準(zhǔn)及要求做好 SPF雞質(zhì)量檢測工作并承擔(dān)相應(yīng)的責(zé)任。

［1］徐桓 .SPF雞群與疫苗生產(chǎn)［J］.中國獸藥雜志.2003，37 (4)：23-25.

［2］秦卓明，張世棟，金維江.對中國SPF雞監(jiān)測的建議［J］.中國家禽.2003，5(18)：6-9.

［3］趙繼勛，秦卓明，張秀美.淺析中國SPF雞微生物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)［J］.山東家禽.1996，2：3-7.

［4］程水生，陳洪巖，李昌文.關(guān)于我國SPF雞卵生產(chǎn)情況的調(diào)查報告［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報.2006，28(5)：606-608.