高玉偉，桑曉宇，3，夏咸柱

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130062；2.吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130062；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150001)

2003以來(lái)，A型高致病性 H5N1亞型禽流感病毒直接突破種間障礙，造成546人感染，330人死亡。2009年4月豬源三重組A型H 1N1亞型流感病毒在人間水平傳播，引發(fā)大流行［1］。動(dòng)物流感病毒特別是A型流感病毒的跨種傳播問(wèn)題引起了人們的高度關(guān)注。A型流感病毒包括16個(gè)血凝素亞型(HA)和9個(gè)神經(jīng)氨酸酶亞型(NA)，理論上可以組合成144種A型流感病毒。依據(jù)宿主來(lái)源可將流感分為人流感、禽流感、馬流感和豬流感等。在自然界中，水禽是A型流感病毒的天然儲(chǔ)存庫(kù)，幾乎所有亞型都可以在水禽中分離到。人流感病毒亞型主要有H1N1、H2N2和H3N2。馬流感病毒只有兩個(gè)抗原性不同的亞型：H7N7和H3N8。豬流感病毒至少有七種不同血清亞型(H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6和H9N2)，其中占絕大多數(shù)的是古典型豬 H 1N1、類(lèi)禽型H1N1和類(lèi)人型H 3N2三種毒株。在過(guò)去的研究中發(fā)現(xiàn)禽流感病毒很難感染人，同樣人流感病毒也無(wú)法有效感染禽類(lèi)，這表明不同物種來(lái)源的A型流感病毒具有相對(duì)嚴(yán)格的種屬特異性。但近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的自然感染事件表明流感病毒能夠跨越種間屏障。例如，禽流感和豬流感對(duì)人的跨種傳播，馬流感 H3N8對(duì)狗的跨種傳播［2］。A型流感病毒跨種傳播取決于病毒因適應(yīng)性變異導(dǎo)致的宿主范圍變化、宿主自身的限制性因素和環(huán)境因素的變化。

1 A型流感病毒的宿主范圍

A型流感病毒對(duì)宿主的吸附能力、復(fù)制能力以及從宿主細(xì)胞內(nèi)的釋放能力決定了病毒感染宿主的宿主范圍。流感病毒對(duì)宿主的吸附能力主要取決于其血凝素蛋白(HA)對(duì)宿主細(xì)胞唾液酸受體(SA)的結(jié)合，而流感病毒的內(nèi)部蛋白影響流感病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制能力。流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)的主要功能是將子代病毒從宿主細(xì)胞表面釋放出來(lái)。

病毒的受體結(jié)合特異性主要決定了病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附能力與感染能力。不同種屬的宿主或同一宿主的不同組織和細(xì)胞的唾液酸受體(SA)的分布具有特異性。流感病毒吸附宿主首先需要血凝素蛋白(HA)與宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體(SA)結(jié)合。宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體(SA)末端的糖鏈的類(lèi)型(α-2，6糖苷鍵或 α-2，3糖苷鍵)影響了流感病毒對(duì)宿主的結(jié)合能力和感染能力。人流感病毒傾向結(jié)合于主要表達(dá)在上呼吸道細(xì)胞和非纖毛細(xì)胞表面的SAα2，6受體，而禽流感病毒傾向結(jié)合主要表達(dá)于禽的腸上皮細(xì)胞和人的下呼吸道細(xì)胞的SAα2，3受體。具有 SAα2，3受體特性的高致病性禽流感病毒(HPAIV)對(duì)禽類(lèi)具有較強(qiáng)的毒力，引起急性病毒性肺炎并且有可能進(jìn)一步發(fā)展成急性呼吸窘迫癥(ARDS)以及多器官衰竭。多數(shù)研究者認(rèn)為這與其具有下呼吸道細(xì)胞組織嗜性有一定的關(guān)系。H3系流感病毒的血凝素蛋白(HA)的受體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)第226位和第228位氨基酸對(duì)于流感病毒的宿主范圍和致病力都具有關(guān)鍵的作用，其主要原因是這兩個(gè)位點(diǎn)決定受體結(jié)合特性。研究發(fā)現(xiàn)，禽流感病毒血凝素蛋白(HA)第226位氨基酸通常是谷氨酰胺(Gln)，其特異結(jié)合 SAα2，3受體；而人 H 2和 H 3流感病毒血凝素蛋白(HA)第226位氨基酸位點(diǎn)通常是亮氨酸，傾向結(jié)合SAα2，6受體。在大多數(shù)人流感病毒中，HA蛋白第226位氨基酸是亮氨酸的同時(shí)第228位氨基酸通常是色氨酸(Ser)；而禽流感中，HA蛋白的第226位和第228位氨基酸通常是谷氨酰胺(Gln)和甘氨酸(Gly)。從人或豬體內(nèi)分離到的H 1亞型流感病毒的HA傾向結(jié)合SAα2，6受體，其 HA的第190位氨基酸通常是天冬氨酸(Asp)并且伴隨著第225位氨基酸是谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)；從禽體內(nèi)分離到的H1亞型流感毒株的這兩個(gè)位點(diǎn)分別是谷氨酸(Glu)和甘氨酸(Gly)，其HA易于結(jié)合SAα2，3受體［3］。H5N1亞型高致病性禽流感病毒只識(shí)別SAα2，3受體，但我們發(fā)現(xiàn)當(dāng) HA的160位氨基酸為丙氨酸(A)時(shí)，H5N1病毒可同時(shí)識(shí)別 SAα2，3受體和SAα2，6受體。如果將該位氨基酸由 A突變?yōu)樘K氨酸(T)時(shí)病毒就會(huì)只識(shí)別 SAα2，3受體，進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)A160T變異可導(dǎo)致HA增加一個(gè)糖基化位點(diǎn)，從而影響了病毒受體結(jié)合特性［4］。除受體結(jié)合特性外，流感病毒的復(fù)制能力同樣影響著病毒的跨種傳播能力。流感病毒需要利用宿主細(xì)胞的復(fù)制系統(tǒng)幫助其復(fù)制。研究人員發(fā)現(xiàn)A型流感病毒的多聚酶蛋白PB2、PA和基質(zhì)蛋白M 1、M 2均會(huì)影響到流感病毒的復(fù)制能力。

2 模型動(dòng)物的宿主限制性

宿主限制性是造成流感病毒具有不同宿主范圍的因素之一。選擇模型動(dòng)物時(shí)首先要考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的宿主限制性，宿主的限制性包括病毒受體和抗病毒天然免疫。

2.1 小鼠

小鼠是用于評(píng)估流感感染最常用的哺乳動(dòng)物模型。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)用小鼠的呼吸道表面具有SAα2，6和SAα2，3兩種唾液酸受體［5］，因而對(duì)人、禽流感病毒都易感。但不同的小鼠分布也不完全相同。BALB/c小鼠的多數(shù)器官都表達(dá)SAα2，6和SAα2，3受體，包括氣管、肺、小腦、脾、肝和腎，而C57BL/6J小鼠的肺中缺乏 SAα2，6受體，SAα2，3則被證明存在纖毛孔和肺泡上皮Ⅱ型細(xì)胞上。雖然實(shí)驗(yàn)小鼠可同時(shí)表達(dá)兩種受體，但人A型流感病毒(H1、H2和H3)一般要經(jīng)過(guò)在小鼠上適應(yīng)性傳代才能有效復(fù)制，而一些低致病性和高致病性禽流感如H 5N1，H2、H6和H7病毒則不需要適應(yīng)性傳代即可感染。從而可以推斷僅由受體分布并不能完全決定流感病毒的宿主范圍。另一個(gè)宿主限制性因素是Mx1蛋白，Mx1蛋白屬于干擾素誘導(dǎo)蛋白家族，可以通過(guò)干擾mRNA合成阻斷流感病毒復(fù)制。大多數(shù)近交系小鼠因攜帶缺陷的Mx1等位基因，對(duì)鼠適應(yīng)流感病毒高度易感［6］。

2.2 雪貂

雪貂一直被視為流感研究的理想動(dòng)物模型。雪貂對(duì)許多種人和禽流感病毒都易感，并且與人在臨床表現(xiàn)、肺功能、氣道形態(tài)、呼吸道細(xì)胞種類(lèi)等方面有許多相似性。雪貂的呼吸道表面具有SAα2，6和SAα2，3兩種受體，SAα2，6受體分布于呼吸道，SAα2，3受體主要分布在下呼吸道末梢呼吸道細(xì)支氣管［7］。人 H3N2流感病毒的吸附和復(fù)制主要在上呼吸道進(jìn)行，然而禽流感病毒的感染和復(fù)制主要在下呼吸道。人流感病毒吸附在呼吸道纖毛上皮細(xì)胞表面和雪貂I型肺泡細(xì)胞，主要引起上呼吸道疾病偶爾也導(dǎo)致支氣管肺炎。禽流感吸附在Ⅱ型肺泡細(xì)胞和細(xì)支氣管，這可以解釋了禽流感引起肺部的嚴(yán)重病變而氣管和細(xì)支氣管所受影響很少的原因。雪貂的其它宿主限制性因素研究的還相對(duì)較少。有趣的是，人們通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)自然感染雪貂的鼻洗液中淋巴細(xì)胞應(yīng)答能力比鼻內(nèi)接種感染的雪貂弱［8］。淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)減少和細(xì)胞免疫的暫時(shí)性損傷均會(huì)導(dǎo)致流感病毒對(duì)雪豹的感染能力增強(qiáng)。

2.3 非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物

各種各樣的非人靈長(zhǎng)動(dòng)物，包括舊大陸猴(恒河猴和獼猴)和新大陸猴(卷尾猴)都已用于流感病毒感染研究。與雪貂不同，流感病毒在非人靈長(zhǎng)動(dòng)物吸附模式和在人呼吸道具有顯著的不同；獼猴感染H3N2病毒后，病毒吸附不發(fā)生在氣管、支氣管或細(xì)支氣管。這就可以解釋為什么獼猴感染人H3N2病毒后臨床癥狀不明顯。部分非人靈長(zhǎng)動(dòng)物對(duì)季節(jié)性流感病毒的敏感性降低歸因于非人靈長(zhǎng)動(dòng)物和人類(lèi)的受體分布不同。我們 H 5N1高致病性流感感染研究中發(fā)現(xiàn)，只有經(jīng)氣管內(nèi)接種，才會(huì)造成病毒性肺炎［9］，單純的經(jīng)鼻腔接種通常只會(huì)形成一過(guò)性的感染。

2.4 豚鼠

豚鼠是近年才開(kāi)始應(yīng)用于流感傳播研究的新模型。豚鼠的鼻腔的呼吸道上皮細(xì)胞的唾液酸受體類(lèi)型為SAα2，6和 SAα2，3，但以 SAα2，6為主，而嗅部為 SAα2，6受體。氣管上皮細(xì)胞表面同時(shí)具有SAα2，6和 SAα2，3類(lèi)型的受體。肺上皮細(xì)胞表面為 SAα2，3受體［4］。

3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在A型流感病毒哺乳動(dòng)物間水平傳播機(jī)制研究中的應(yīng)用

雪貂是最早應(yīng)用于A型流感病毒傳播機(jī)制研究的模型動(dòng)物。但由于雪貂價(jià)格較貴并且飼養(yǎng)條件要求高，應(yīng)用并不廣泛。一些研究者試圖用小鼠作為評(píng)價(jià)模型，但絕大多數(shù)流感病毒都不能在小鼠中傳播，甚至 1918H1N1也未能引起傳播。2006年，Peter Palese［10］發(fā)現(xiàn)豚鼠適合研究流感病毒的傳播。人流感病毒在豚鼠中可以高效傳播(包括接觸性傳播和非接觸性傳播)。體積較小、價(jià)格低廉的豚鼠成為研究流感病毒傳播又一個(gè)重要的哺乳動(dòng)物模型，但和雪貂不同，感染的豚鼠臨床癥狀并不明顯，即使是H5N1亞型高致病性禽流感病毒對(duì)豚鼠也不具有明顯的致病性。

近些年來(lái)，通過(guò)使用模型動(dòng)物，已發(fā)現(xiàn)了一些影響流感病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的跨種感染和傳播的分子機(jī)制。Gao等［11］用豚鼠模型發(fā)現(xiàn)并證明 PB2基因701位點(diǎn)的天冬酰氨是H5N1亞型禽流感病毒在哺乳動(dòng)物中水平傳播的必需前提；并發(fā)現(xiàn)HA基因的160氨基酸由T突變?yōu)锳，導(dǎo)致158-160位糖基化位點(diǎn)缺失，可使H 5N1病毒結(jié)合人的SAα2，6受體，并獲得在哺乳動(dòng)物間的水平傳播能力。Hoeven等［12］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于 H1N1亞型流感病毒而言，血凝素蛋白(HA)的受體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的第190位和225位氨基酸對(duì)于不同來(lái)源的H1N1流感病毒在雪貂群中空氣傳播能力影響很大。第190位和第225位均為天冬氨酸的人源 H1N1可以在雪貂群中高效的發(fā)生空氣傳播，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)1918H1N1“西班牙流感”病毒PB2蛋白的第627位氨基酸影響其在雪貂中的傳播能力，該點(diǎn)為賴(lài)氨酸的1918H1N1流感病毒能夠在雪貂群中高效傳播；當(dāng)該位點(diǎn)突變?yōu)楣劝彼釙r(shí)，突變的1918H1N1流感病毒在雪貂群中的傳播能力明顯減弱。Steel等［13］在研究 PB2蛋白氨基酸位點(diǎn)對(duì)于流感病毒傳播能力的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，將一株人季節(jié)性流感H 3N2的PB2蛋白第627位氨基酸由賴(lài)氨酸突變?yōu)楣劝彼?，突變后的流感病毒與其母本相比，在豚鼠間的空氣傳播能力明顯減弱。除病毒自身的因素外，溫度和相對(duì)濕度對(duì)于生物氣溶膠的傳播影響較大。Palese等［14］利用豚鼠模型研究環(huán)境溫度和相對(duì)濕度對(duì)于流感病毒在豚鼠間傳播能力的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，低溫(5℃)有利于流感病毒在豚鼠間的空氣傳播而高溫阻礙傳播。當(dāng)環(huán)境溫度為20℃時(shí)，低相對(duì)濕度有利于流感病毒在豚鼠間空氣傳播；研究者認(rèn)為不同的相對(duì)濕度影響了流感病毒氣溶膠在空氣中的衰減速度和傳播距離。Hemmes等［15］用直徑在5～6um的流感病毒氣溶膠研究生物半衰期時(shí)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)濕度小于40%時(shí)流感病毒氣溶膠的衰減速度最慢，并且其衰減速度隨著相對(duì)濕度的升高而加快。不僅如此，Schaffer等［16］發(fā)現(xiàn)相對(duì)濕度對(duì)于流感病毒氣溶膠的穩(wěn)定性有一定影響，流感病毒氣溶膠在相對(duì)濕度為20%時(shí)粒子穩(wěn)定性最高；在相對(duì)濕度為50% ～60%之間時(shí)穩(wěn)定性最差；而在高相對(duì)濕度時(shí)居中。Lowen等［17］用豚鼠模型證明了高溫(30℃)可以阻斷流感病毒氣溶膠在任何相對(duì)濕度下的空氣傳播，但是并不能阻斷流感病毒在豚鼠間的接觸性傳播或飛沫傳播。研究者認(rèn)為，流感病毒在熱帶地區(qū)和亞熱帶地區(qū)的反復(fù)不定期流行的一個(gè)原因可能是發(fā)生在此地區(qū)的流感病毒主要是以接觸性傳播或飛沫傳播為主，而溫帶地區(qū)的流感主要以空氣傳播為主，因此更易發(fā)生季節(jié)性流感。

4 結(jié)語(yǔ)：

通過(guò)使用模型動(dòng)物，人們對(duì)流感病毒傳播機(jī)制的認(rèn)識(shí)和理解在逐漸加深。但現(xiàn)有的模型還不能完全滿(mǎn)足傳播機(jī)制研究的需要，還需要更廣泛的選用模型。如雪貂因?qū)α鞲羞^(guò)于敏感而在實(shí)驗(yàn)中難于控制，豚鼠感染流感后不表現(xiàn)臨床癥狀而無(wú)法全面模擬病毒在人與人之間傳播的現(xiàn)象。此外，目前發(fā)現(xiàn)的一些影響傳播的病毒氨基酸并不具有普遍的代表性，說(shuō)明病毒的傳播受多基因和多因素的影響，還需要進(jìn)一步的研究。

［1］WHO，WHO.http://www.who.int/en/，2011.

［2］Yamanaka，T.，et al.，Interspecies transm ission of equine influenza virus(H3N8) to dogs by close contact with experimentally infected horses［J］.Vet Microbiol，2009.139(3-4)：p.351-5.

［3］Ge，S.and Z.Wang，An overview of Influenza A virus receptors［J］.Crit Rev Microbiol，2011.37(2)：p.157-65.

［4］Gao，Y.，et al.，Identification of amino acids in HA and PB2critical for the transmission of H5N1avian influenza viruses in a mammalian host［J］. PLoS Pathog， 2009. 5(12)：p.e1000709.

［5］Ning，Z.Y.，et al.，Detection of expression of influenza virus receptors in tissues of BALB/c mice by histochemistry［J］.Vet Res Commun，2009.

［6］Salomon，R.，et al.，Mx1gene protects mice against the highly lethal human H5N1influenza virus［J］.Cell Cycle，2007.6(19).

［7］Thongratsakul，S.，et al.，Avian and human influenza A virus receptors in trachea and lung of animals［J］.Asian Pac J A llergy Immunol，2010.28(4)：p.294-301.

［8］Herlocher，M.L.，et al.，F(xiàn)errets as a transmission model for influenza：sequence changes in HA1of type A(H3N2)virus［J］.J Infect Dis，2001.184(5)：p.542-6.

［9］Fan，S.，et al.，Immunogenicity and protective efficacy of a live attenuated H5N1vaccine in nonhuman primates［J］.PLoS Pathog，2009.5(5)：p.e1000409.

［10］Lowen，A.C.，et al.，The guinea pig as a transmission model for human influenza viruses［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2006.

［11］Gao，Y.，et al.，Identification of amino acids in HA and PB2critical for the transmission of H5N1avian influenza viruses in a mammalian host［J］.PLoS Pathog，2009.5：p.e1000709.

［12］Van Hoeven，N.，et al.，Human HA and polymerase subunit PB2proteins confer transm ission of an avian influenza virus through the air［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2009.106(9)：p.3366.

［13］Steel，J.， et al.， Transmission of influenza virus in a mammalian host is increased by PB2amino acids 627K or 627E/701N［J］.PLoS Pathog，2009.5(1)：p.e1000252.

［14］Lowen，A.C.，S.Mubareka，and J.Steel，Influenza Virus Transm ission Is Dependent on Relative Humidity and Temperature［J］.PLoS Pathogens，2007.Volume 3(Issue 10)：p.1470-1476.

［15］Hemmes，J.，K.W inkler，and S.Kool，Virus survival as a seasonal factor in influenza and poliomyelitis［J］.Antonie Van Leeuwenhoek，1962.28(1)：p.221-233.

［16］Schaffer，F(xiàn).，M.Soergel，and D.Straube，Survival of airborne influenza virus：effects of propagating host，relative humidity，and composition of spray fluids［J］.Archives of Virology，1976.51(4)：p.263-273.

［17］Lowen，A.C.，J.Steel，and S.Mubareka，High Temperature (30℃)Blocks Aerosol but Not Contact Transm ission of Influenza Virus［J］.JOURNAL OF VIROLOGY，2008.Vol.82，(No.11)：p.5650-5652.