楊松濤，梁 萌，王承宇，李忠義

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130122)

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疫病防控的重要性

動(dòng)物試驗(yàn)/實(shí)驗(yàn)是生命科學(xué)研究的重要部分。疾病動(dòng)物模型的建立；發(fā)病機(jī)制探索；生物安全評(píng)價(jià)；食品安全評(píng)價(jià)；藥物篩選；生物制品檢定；基因工程研究；進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫；生物新技術(shù)應(yīng)用等都離不開(kāi)動(dòng)物試驗(yàn)，真實(shí)可靠的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果對(duì)研究結(jié)論具有至關(guān)重要的作用。小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、犬、貓、猴等都是重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在生命科學(xué)研究中發(fā)揮著十分重要的作用。由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多源于野生動(dòng)物和家養(yǎng)動(dòng)物，在群體飼養(yǎng)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中容易受到易感病原感染，造成疫病暴發(fā)或流行，以至影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差，甚至可能造成實(shí)驗(yàn)中斷；還可能污染實(shí)驗(yàn)材料，威脅其它動(dòng)物或人類健康。因此，了解常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重要疫病并開(kāi)展其防控研究十分必要。

2 犬、貓、猴等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重要疫病及其防控研究

2.1 犬瘟熱

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起的病毒性傳染病。在自然條件下，CDV能夠感染犬科、鼬科、浣熊科、大熊貓科、貓科和靈長(zhǎng)類等多種動(dòng)物［1，2］。臨床上，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、膿性鼻炎、肺炎、腸炎和結(jié)膜炎，有時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，后期出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀及以足墊增厚為特征。患病動(dòng)物在康復(fù)后還易留有麻痹、抽搐、癲癇樣發(fā)作等后遺癥。該病傳染性強(qiáng)，發(fā)病率可達(dá)100%，病死率達(dá)80%，對(duì)犬科動(dòng)物危害十分嚴(yán)重，容易繼發(fā)其他細(xì)菌、病毒的混合感染和二次感染。近年來(lái)，CDV的宿主范圍不斷地?cái)U(kuò)大，對(duì)犬、貓、猴等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物構(gòu)成極大威脅［3，4］。

防治犬瘟熱的有效途徑是疫苗接種。滅活疫苗抗原性差，且僅能誘導(dǎo)體液免疫，現(xiàn)已少用。取而代之的弱毒疫苗應(yīng)用獲得了一定的免疫效果，但能引起免疫抑制并且在一定程度上損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)；且CDV自然感染宿主范圍在不斷擴(kuò)大，因此，即使對(duì)犬安全的犬瘟熱弱毒活疫苗，對(duì)其他動(dòng)物并不一定安全，并可能致死這些動(dòng)物和帶來(lái)散毒的危險(xiǎn)［6］。軍事獸醫(yī)研究所成功克隆了犬瘟熱病毒小熊貓株(CDV LP)N蛋白和 F蛋白基因全長(zhǎng)cDNA，分別構(gòu)建了犬瘟熱病毒基因疫苗表達(dá)載體pCIN和 pCIF，并在 MDCK細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)［5］。以含CAV-2SY弱毒株全基因組的pPoly2-CAV-2為載體分別構(gòu)建了基于pVAX1載體表達(dá)元件的CDV N蛋白重組犬2型腺病毒 CAV-2-pVAXLPN、F蛋白重組犬 2型腺病毒 CAV-2-pVAXLPF及 CAV-2-pCILPF，免疫犬實(shí)驗(yàn)表明CAV-2-pCILPF誘導(dǎo)犬產(chǎn)生的抗體效價(jià)高于 CAV-2-pVAXLPF。將基因疫苗與3株重組腺病毒以不同的組合方式進(jìn)行了免疫犬實(shí)驗(yàn)及攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)免疫結(jié)果表明，基因疫苗和重組腺病毒免疫動(dòng)物后能引起機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答［7］。

2.2 犬細(xì)小病毒病

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(canine parvovirus，CPV)感染所引起的一種接觸性傳染病。犬是 CPV的主要自然宿主，家貓對(duì)實(shí)驗(yàn)性CPV有易感性，但其臨床癥狀并不明顯。豚鼠、倉(cāng)鼠以及小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均不感染。犬感染CPV后發(fā)病較急，傳染性強(qiáng)，對(duì)幼犬威脅尤其嚴(yán)重［8，10］。病犬常表現(xiàn)精神沉郁，有時(shí)出現(xiàn)體溫升高，脫水，嘔吐，排出粘液狀或帶血的稀便。幼犬死亡率高達(dá)30%～70%。健康犬通過(guò)直接接觸病犬，攝入污染的食物、飲水或者接觸食具、墊料而被感染。

用于該病預(yù)防的疫苗有滅活疫苗、弱毒疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗以及重組疫苗。CPV滅活疫苗接種后，能誘導(dǎo)抗CPV的特異性免疫反應(yīng)，抵抗CPV強(qiáng)毒的攻擊，但其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間短，血清抗體持續(xù)時(shí)間不超過(guò) 6個(gè)月［11，12］。軍事獸醫(yī)研究所于1986年從貉體內(nèi)分離到了一株CPV自然弱毒(PV/貉/CC/1/86)，接種犬能誘導(dǎo)良好的免疫反應(yīng)，臨床應(yīng)用已有10多年的歷史，效果良好并且安全可靠。此外，還進(jìn)一步克隆了PV/貉/CC/1/86的VP2基因制備核酸疫苗，免疫接種小鼠和犬，均能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗 CPV的體液免疫和細(xì)胞免疫［13］。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了以 CAV-2為載體表達(dá)CPV VP2基因的重組病毒，犬免疫實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛲瑫r(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗 CPV和CAV-2的特異性免疫反應(yīng)。為進(jìn)一步研制開(kāi)發(fā)用于家犬及試驗(yàn)用犬的新型疫苗奠定了基礎(chǔ)［14］。

2.3 貓瘟熱

貓瘟熱是由貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV)引起的一種病毒性傳染病。在自然條件下，F(xiàn)PV能感染貓科、鼬科和浣熊科等多種動(dòng)物，但以體型較小的貓科動(dòng)物最為易感［9，10］。病貓出現(xiàn)高熱、嘔吐、白細(xì)胞嚴(yán)重減少和腸炎等臨床特征，嚴(yán)重的還出現(xiàn)血便，最后出現(xiàn)嚴(yán)重脫水，衰竭死亡。幼貓死亡率可達(dá)到90%。

目前用于FPV免疫預(yù)防的疫苗有滅活疫苗、弱毒疫苗及應(yīng)用基因工程手段研制的基因工程亞單位疫苗、基因疫苗、活載體疫苗等新型疫苗。軍事獸醫(yī)研究所在畢赤酵母中表達(dá)了 FPV VP2蛋白［15］，同時(shí)利用 CAV2為載體制備了表達(dá) VP2的重組活疫苗，分別免疫小鼠和貓，均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗FPV HI抗體和中和抗體［16］。

2008年，我們從腹瀉猴腸內(nèi)容物中分離獲得了一株病毒。序列分析表明該病毒為細(xì)小病毒，10個(gè)關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)中8個(gè)與 FPV相同，2個(gè)與CPV相同［17］。實(shí)驗(yàn)研究表明，此次從猴體分離獲得的細(xì)小病毒是FPV的變異株。到目前為止尚無(wú)FPV感染猴并引起死亡的報(bào)道。與 FPV相比，2個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸發(fā)生變化是否是決定FPV宿主范圍發(fā)生變化并獲得了跨種感染猴的能力的關(guān)鍵性因素；而該突變是如何發(fā)生的，在決定對(duì)猴的致病性上是否起關(guān)鍵作用等尚有待進(jìn)一步研究［18］。

2.4 布病

布魯氏菌病簡(jiǎn)稱“布病”，是由布魯氏菌引起的人獸共患傳染病。其常見(jiàn)宿主有牛、羊、豬、犬、鼠類等，該病對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物威脅嚴(yán)重。動(dòng)物感染布病后，主要受侵害的是生殖器官，導(dǎo)致流產(chǎn)、不育、睪丸炎以及關(guān)節(jié)炎等。

目前用于布病預(yù)防的滅活疫苗免疫效果較差；弱毒疫苗有一定的毒副作用，并且免疫后動(dòng)物與自然感染的動(dòng)物不能有效進(jìn)行區(qū)分，影響了布病的診斷和檢疫，從而直接影響到了疫苗的廣泛使用［19］。軍事獸醫(yī)研究所通過(guò)構(gòu)建自殺質(zhì)粒，采用同源重組的方法，在疫苗株 S19的基礎(chǔ)上成功地構(gòu)建出了分子標(biāo)記、毒力基因缺失疫苗株。研究結(jié)果證明，該疫苗株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，有

可識(shí)別的分子標(biāo)記(利用血清學(xué)方法可區(qū)分疫苗免疫和自然感染的動(dòng)物)，同時(shí)缺失主要的毒力基因。該疫苗株與原疫苗株在免疫原性上差異不顯著，并且毒力明顯降低，從而為布病分子標(biāo)記、毒力基因缺失疫苗的研究奠定了較好的基礎(chǔ)［20］。

2.5 鉤體病

鉤端螺旋體病是由致病性鉤端螺旋體(leptospira interrogans，簡(jiǎn)稱鉤體)引起的一種人獸共患傳染病。臨床上以早期出現(xiàn)鉤端螺旋體敗血癥，中期出現(xiàn)各器官損害和功能障礙，以及后期出現(xiàn)各種變態(tài)反應(yīng)后發(fā)癥為特點(diǎn)。鉤體病的主要傳染源為鼠、豬及其它家畜，犬類是鉤體的易感動(dòng)物。鉤體隨帶菌動(dòng)物的尿液排出，污染水源。一旦暴發(fā)，對(duì)鼠、犬等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物危害較大，嚴(yán)重影響到試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)可靠性。

鉤體疫苗分為滅活疫苗、外膜疫苗、基因工程疫苗。范泉水等擬通過(guò)對(duì)保護(hù)性抗原基因進(jìn)行篩選、克隆和擴(kuò)增后，進(jìn)行重組鉤體基因多肽疫苗或鉤體蛋白亞單位疫苗的研制，并將其開(kāi)發(fā)成一種安全的疫苗候選株［21］。

2.6 弓形蟲(chóng)病

弓形蟲(chóng)病是由弓形蟲(chóng)引起的一種世界性分布的人獸共患寄生蟲(chóng)病。其終末宿主主要是貓科動(dòng)物，中間宿主是人、哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類和魚(yú)類。貓、犬、豬、羊、牛、兔等感染弓形蟲(chóng)的情況非常普遍，其感染率可高達(dá)10%～50%，對(duì)實(shí)驗(yàn)鼠、兔、犬、貓威脅較大。感染的幼年動(dòng)物明顯發(fā)熱、咳嗽、厭食、衰弱、流產(chǎn)和死亡。

迄今為止仍沒(méi)有理想的防治弓形蟲(chóng)病藥物，弓形蟲(chóng)疫苗的研制經(jīng)歷了全蟲(chóng)疫苗、亞單位疫苗、基因工程疫苗和核酸(DNA)疫苗等幾個(gè)階段［22］。我國(guó)軍事獸醫(yī)研究所構(gòu)建了弓形蟲(chóng)SAG1和ROP2基因的真核表達(dá)載體、卡介苗穿梭表達(dá)載體和表達(dá)SAG1的重組偽狂犬病病毒［22，24］。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明原核表達(dá)產(chǎn)物、真核表達(dá)載體、重組卡介苗及重組偽狂犬病病毒均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫，并且 IL-18能明顯增強(qiáng)上述真核表達(dá)載體的免疫反應(yīng)，其中重組偽狂犬病病毒在小鼠體內(nèi)能達(dá)到60%的保護(hù)率，具有一定的應(yīng)用前景。

3 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是研究生命科學(xué)的基礎(chǔ)。人類探索生命的起源，揭開(kāi)遺傳的奧秘，攻克癌癥的堡壘，研究各種疾病與衰老的機(jī)制都必須借助于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。要獲得理想的研究結(jié)果，首先要有標(biāo)準(zhǔn)化的健康無(wú)病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因此，重視并加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重要疾病的科學(xué)防控對(duì)于確保研究人員獲取真實(shí)可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有十分重要的意義。

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