趙紅梅，盛敏杰，于 靖

（同濟大學附屬第十人民醫(yī)院眼科，上海 200072）

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreoretinopathy，PVR）是導致視網(wǎng)膜脫離手術(shù)失敗的主要原因之一。眼外傷或者視網(wǎng)膜破裂后，RPE細胞、müller細胞等從原位遷移至玻璃體腔發(fā)生增殖和收縮。在此過程中，細胞因子大量產(chǎn)生，膠原和纖維樣物質(zhì)大量堆積，形成視網(wǎng)膜前膜或視網(wǎng)膜下膜，從而引起牽引性視網(wǎng)膜脫離，嚴重影響視力［1］。根據(jù)其病理過程，人們建立各種不同類型的PVR模型，以更好的研究該病的發(fā)病機制和防治。

1 模型中常用的動物

1.1 兔子

兔子因為性情溫順、眼球大，晶狀體相對小、玻璃體腔體積相對較大，便于進行眼科手術(shù)操作和觀察等優(yōu)點而成為PVR模型中最常用的實驗動物。最常用的品種是新西蘭白兔、青紫藍兔、中國本種兔等。但是缺點是：兔子和人類的眼底構(gòu)造稍有不同，兔子沒有黃斑中心凹，存在髓線。總體而言，PVR比較容易發(fā)生。

1.2 鼠類

大鼠和小鼠也可用于PVR模型，鼠類具有繁殖能力強、飼養(yǎng)管理方便，易于控制、遺傳基因組和組織解剖結(jié)構(gòu)和人相似性高等優(yōu)點。目前在PVR小鼠模型中應用最多的是C57BL/6J小鼠，常用于PVR大鼠模型中的封閉群有：Wistar、Spraque-Dawley大鼠、Brown-Norway大鼠，近交系有Lewis大鼠。大鼠和小鼠應用于此模型的缺點是：眼球體積小，晶狀體接近于球形，玻璃體腔體積相對較小，不易于玻璃體腔注射等操作，而且觀察不方便。

1.3 其他動物

小型豬、貓以及靈長類動物等也可用于PVR動物模型的建立，但是由于倫理、價格等原因而應用較少。

2 PVR動物模型的建立方法

為了研究PVR的病理發(fā)展過程和治療，現(xiàn)在已不止有25種模型的建立方法［2］。

2.1 玻璃體腔注入細胞

由于玻璃體腔注射后會發(fā)生高眼壓等并發(fā)癥，大多數(shù)學者在玻璃體腔注射之前會先行玻璃體切割，可以用氣體壓迫、手術(shù)機械性切割［3］等方式，也可以先注射透明質(zhì)酸酶待玻璃體液化［4］，以利于細胞在玻璃體腔的移行，促進PVR的發(fā)生。PVR以及牽引性視網(wǎng)膜脫離的程度與注入的細胞數(shù)量呈劑量-效應關(guān)系，根據(jù)這一關(guān)系，可選擇出注入細胞的合適數(shù)量，制成相應的模型。

2.1.1 RPE細胞：這是PVR動物模型造模方法中最常用的方法之一。這種方法可以模擬RPE細胞在玻璃體內(nèi)的增殖、移行和分化等過程，而且RPE細胞能分泌多種細胞因子，促進膠原和纖維的形成，形成明顯的視網(wǎng)膜前膜，很好的突出了疾病的本質(zhì)，并且可以進行定性、定量研究，可重復性強?？梢杂米泽w同源、同種異體或者異種的RPE細胞。為了提高造模成功率也可以聯(lián)合富含血小板血漿或者müller細胞。

2.1.2 成纖維細胞：將成纖維細胞注入玻璃體切割后的眼內(nèi)，也可制作成典型的PVR模型。成纖維細胞注入眼內(nèi)后，就會以殘余的玻璃體膠原和透明質(zhì)酸為支架生長繁殖，形成模樣物，牽拉下方的視網(wǎng)膜，造成后部PVR。成纖維細胞容易獲取，培養(yǎng)時生長良好。細胞可以取自自體或異體的皮膚［5］、結(jié)膜［6］等組織。異體和自體成纖維細胞的結(jié)果在時間和程度方面無差異。并且此模型容易重復，這種造模方法也備受青睞。

2.1.3 巨噬細胞：巨噬細胞是一種終末細胞，不能轉(zhuǎn)化和增生，但它們能分泌多種細胞因子。將巨噬細胞注射到玻璃體腔也能形成PVR動物模型［7］。在此模型中，眼內(nèi)的增生細胞如RPE細胞等均來自宿主自身，這種模型以炎癥啟動階段為起點，可用于觀察早期的炎性細胞因子的含量變化及對細胞增生的調(diào)控作用。而且巨噬細胞的采集和純化相對簡單。

2.1.4 神經(jīng)膠質(zhì)細胞：將神經(jīng)膠質(zhì)細胞注入大鼠玻璃體腔也可以建立PVR模型。Francine等［8］在大鼠玻璃體腔單一注射RPE細胞、müller細胞以及聯(lián)合注射，發(fā)現(xiàn)在大鼠PVR模型中，müller細胞誘導PVR的能力大于RPE細胞，而且聯(lián)合注射明顯優(yōu)于單一細胞注射。

2.1.5 其他類型細胞：內(nèi)皮細胞、軟骨細胞、胚胎細胞等也可以用于PVR建模［9］。但是由于此過程與PVR自然發(fā)病過程相距甚遠，實際應用較少。

2.2 玻璃體腔注射富含血小板血漿或富含血小板血漿聯(lián)合細胞

富含血小板血漿（platelet-rich-plasma，PRP）中富含大量的血小板，血小板可以分泌多種細胞因子，比如PDGF、TGF等，這些因子可以促進細胞的增殖、纖維的形成，促進纖維向視網(wǎng)膜粘附，形成PVR模型。

PRP聯(lián)合細胞注入玻璃體腔時，PRP中細胞因子的釋放對注入細胞有促增生、促粘附的作用，能更好的建立PVR模型。Zheng等［10］嘗試了在大鼠玻璃體腔單純注射RPE-J細胞、玻璃體腔單純注射PRP、玻璃體腔聯(lián)合注射RPE-J細胞和PRP三種方法來建立大鼠PVR模型，最后發(fā)現(xiàn)玻璃體腔聯(lián)合注射的建模成功率明顯高于單獨注射。

2.3 較大鞏膜切口制成的PVR模型

有鞏膜切口存在時，眼部的細胞如RPE細胞等直接暴露于玻璃體環(huán)境中，由于微環(huán)境的改變，RPE細胞發(fā)生遷移和增生，轉(zhuǎn)化成成纖維細胞，有收縮膠原和纖維的活性。與人孔源性視網(wǎng)膜脫離引起的PVR發(fā)生過程相似，聯(lián)合玻璃體腔注射細胞或者富含血小板血漿等操作能成功的建立PVR動物模型，但是外傷性PVR模型是人為的造成網(wǎng)脫，并不是由于玻璃體牽引引起的裂孔，而且手術(shù)操作復雜，影響因素較多，難以定量，病變程度的一致性和模型的可重復性較差。

由較大鞏膜穿孔傷以及眼后段穿孔傷制成的PVR模型與人外傷所致的PVR的發(fā)生相似，但這一模型由于血液存留在玻璃體內(nèi)，使早期眼底窺不清，不利于早期觀察。

2.4 dispase酶消化法

dispase是細胞實驗時常用的一種分解組織的酶，可以選擇性的降解四型膠原和纖維連接蛋白，降解細胞外基質(zhì)，為細胞的移行和分化創(chuàng)造條件。注射時，或多或少都有出血的發(fā)生，血液中的淋巴細胞、血小板等都參與了PVR的發(fā)生。Elizabeth等［11］首次報道了可以用dispase建立PVR模型，而且玻璃體腔或者視網(wǎng)膜下腔注射dispase，都可以成功建立PVR的兔模型，最佳劑量是0.05U～0.07U。dispase用量小，價格便宜，且建模操作簡單，對動物的創(chuàng)傷小，而且不需要引入外源的細胞成分，與臨床PVR更接近。但是這種造模方法有較多的副作用［12］，比如晶體脫位、白內(nèi)障等。因為內(nèi)界膜成分和基底膜非常相似，dispase分解基底膜的同時也破壞了內(nèi)界膜的本身結(jié)構(gòu)，使müller細胞足板暴露［13］，在使用dispase建立PVR模型時要考慮到這些副作用。

2.5 玻璃體腔注射細胞因子

細胞因子如IL-1β、PDGF等可以促進RPE細胞等的增殖、遷移、分化等活性，將其注射到玻璃體腔也可以造成PVR模型。Gregory等［14］在外力造成視網(wǎng)膜裂孔后，將IL-1β注入玻璃體腔，也可以造成兔PVR模型，但是這種造模方法由于引入了外源性的細胞因子，與臨床所見的PVR的發(fā)生發(fā)展過程較大差異，因此限制了這種方法的使用。

2.6 其他方法

Shizuya等將小鼠的晶體摘除，直接外力損傷RPE細胞層，也可以造成小鼠前部PVR模型［15］，但是模型與臨床PVR相差甚遠，應用有限；此外在鞏膜傷后向玻璃體腔注入全血［16］或者血小板［17］也能誘導PVR的發(fā)生，但是所需時間比較長，增生程度輕；也有學者用眼內(nèi)異物造模，但是鐵等異物的存在會造成視網(wǎng)膜明顯的毒性作用；也可用轉(zhuǎn)基因［18］］的方法來誘導細胞因子的表達從而形成PVR，但此法對實驗操作技術(shù)的要求較高。

3 PVR模型評價方法和分級

3.1 模型的評價方法

PVR建模后一周內(nèi)每天用直接眼底鏡或間接眼底鏡觀察眼底，之后每周觀察一次眼底，觀察周期一般是28d以上，眼底鏡檢查主觀性較強。也可以用眼科B超來輔助診斷有無PVR的發(fā)生，適用于兔子等眼球較大的動物，但是鼠類眼球小，一般的B超探頭難以分辨模型建立與否。也可以選擇用光學相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）或者視網(wǎng)膜電圖（electroretinogram，ERG）來評價模型，此外，螺旋CT可以對兔眼PVR模型中增殖膜的密度等進行定性和定量分析［19］。在諸多方法中，最客觀的評價方法是組織病理切片，可以從組織學角度客觀的評價模型建立與否。

3.2 模型的分級

在兔PVR模型的分級中，應用最多的是Fasternburg分級標準［20］。該標準共有五個等級：I級眼底正常，玻璃體內(nèi)可見增殖條帶；Ⅱ級局灶性牽拉，局限性血管改變，充血擴張等；Ⅲ級髓線處的局限性網(wǎng)脫以及視網(wǎng)膜皺褶；Ⅳ級廣泛的視網(wǎng)膜脫離，全部髓線脫離，視盤周圍視網(wǎng)膜脫離；Ⅴ級視網(wǎng)膜全脫離、對折以及裂孔形成。

Weiss等［21］將兔PVR模型按照病變程度分為六級：0級無增生；0.5級玻璃體勉強可見增生痕跡；1級有細小增生束，但無真正的條索形成；2級有濃厚的增生束形成；3級有細薄的增生條索；4級有濃厚的增生條索。

我國的梁厚成等［22］也制定了兔PVR模型的分級標準：0級：眼底正常未見增生；I級：玻璃體內(nèi)有少量纖細的增生條帶；Ⅱ級：玻璃體內(nèi)有較多粗大的增生條帶；Ⅲ級：玻璃體內(nèi)有膜狀增生條帶；Ⅳ級：增生條帶牽拉髓線抬高，或有局部視網(wǎng)膜脫離。

Francine等［8］制定了Lewis大鼠PVR的分級標準：0級無增殖反應；1級玻璃體內(nèi)增殖；2級視網(wǎng)膜前膜以及視網(wǎng)膜皺褶形成；3級視網(wǎng)膜前有致密白膜形成，視網(wǎng)膜皺褶、局限性網(wǎng)脫，伴有或不伴有局限性后囊膜型白內(nèi)障。

Zheng［10］制定了Wistar大鼠PVR模型的分級標準：0級無增殖反應；1級玻璃體霧狀渾濁，增殖條帶形成；2級單個或者多個象限的視網(wǎng)膜皺褶；3級單個象限的視網(wǎng)膜前膜形成；4級兩個或兩個以上象限的視網(wǎng)膜前膜形成。

4 問題與展望

目前PVR模型的所用動物還是以兔子為多，且造模方法復雜，不同的造模方法建立的模型有差異。就實驗效果而言，聯(lián)合注射不同的細胞或者細胞和PRP聯(lián)合注射成膜率更高，就實驗操作而言，兔子玻璃體腔較大，易于觀察，而且單純玻璃體腔注射操作相對容易。實驗者要分析各種方法的利弊，從實驗目的著手選擇合適的實驗動物和實驗方法來建立PVR動物模型。相信以后會有簡單易行而又穩(wěn)定的造模方法出現(xiàn)，以便更好的研究該疾病。

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