魏 強(qiáng)，秦 川

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

我國(guó)是人口大國(guó)，也是多種重大傳染病、感染性疾病多發(fā)國(guó)家之一。艾滋病、結(jié)核病、乙型肝炎、SARS、手足口病、禽流感和甲型H1N1流感等重大感染性疾病都使我國(guó)面臨重大挑戰(zhàn)。但對(duì)于治療，包括預(yù)防性和治療性疫苗免疫目前還受到很大的限制，主要集中在以下諸多方面，如病原生物學(xué)特性尚未完全清楚，致病的機(jī)制不十分清楚，藥物、疫苗篩選在很大程度上缺乏動(dòng)物模型。對(duì)感染性疾病或病原性動(dòng)物模型的認(rèn)識(shí)，也一直存在不足，甚至不十分正確，因此，制備的動(dòng)物模型不規(guī)范，針對(duì)性不強(qiáng)，甚至不是真正意義上的動(dòng)物模型。

早期，確定病毒性病原作為某種疾病的病原，需滿足Koch定律6項(xiàng)要素，即能從患者中分離到病毒；能在某種宿主細(xì)胞中培養(yǎng)；病原具有濾過(guò)性；在同一宿主種類或相關(guān)動(dòng)物種類中能復(fù)制疾?。辉诟腥镜膭?dòng)物中能再分離到病毒；并且能檢測(cè)到針對(duì)此病毒產(chǎn)生的特異性免疫反應(yīng)［1］。這些要素也成為動(dòng)物模型的重要參考指標(biāo)，后兩條“在感染的動(dòng)物中能再分離到病毒”和“并且能檢測(cè)到針對(duì)此病毒產(chǎn)生的特異性免疫反應(yīng)”，是制備動(dòng)物模型的關(guān)鍵。

感染性疾病特性之一是疾病因明確的病原引起，包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)等生物體感染機(jī)體，導(dǎo)致疾病發(fā)生。因此，動(dòng)物模型的研究，關(guān)鍵點(diǎn)是病原對(duì)動(dòng)物的致病性問(wèn)題，也就是說(shuō)，動(dòng)物能不能被病原感染，復(fù)制、模擬出全部或部分疾病特征的問(wèn)題。一般來(lái)講，病原進(jìn)化伴隨著宿主或寄生、相伴動(dòng)物同時(shí)進(jìn)化，因此，形成了相互依存、共處、排斥等關(guān)系，這種相互依存、共處、排斥關(guān)系，表現(xiàn)為共生關(guān)系、機(jī)體損傷（疾?。?、病原不能存活等情況。病原依據(jù)種類和生物學(xué)特性不同，分為體外寄生感染，器官、組織內(nèi)感染（包括血液）和細(xì)胞內(nèi)感染幾種形式，因此，感染的機(jī)制明顯不同，對(duì)感染動(dòng)物宿主特異性選擇要求也不同，一般依寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和病毒的順序特異性增強(qiáng)，特別是病毒性病原，其感染往往通過(guò)特異性受體進(jìn)入細(xì)胞，而受體的進(jìn)化在不同動(dòng)物體內(nèi)變化程度有時(shí)并不隨動(dòng)物種類近似而接近，因此，給動(dòng)物模型的制備帶來(lái)了不確定性和復(fù)雜性，這也是目前有些病原沒(méi)有理想的動(dòng)物模型的原因之一。但同時(shí)，由于各種動(dòng)物遺傳構(gòu)成和生物學(xué)特性既有相似的一面又有不同的一面，也使得遺傳距離大的動(dòng)物作為感染病模型成為了可能［2，3］。因而，感染性動(dòng)物模型研究，特別是新發(fā)感染性疾病病原，面臨的第一個(gè)問(wèn)題是動(dòng)物的感染性，或稱為動(dòng)物敏感性的問(wèn)題，往往通過(guò)大量不同種類動(dòng)物的測(cè)試、篩選，才能研制出較為理想的模型［4，5］。關(guān)于感染性疾病模型制備，提出以下一些觀點(diǎn)。

1 感染性疾病動(dòng)物模型制備的一般原則

感染性疾病動(dòng)物模型，顧名思義，是以導(dǎo)致感染性疾病的病原感染動(dòng)物，或人工導(dǎo)入病原遺傳物質(zhì)，使動(dòng)物發(fā)生和人類相同疾病、類似疾病、部分疾病改變或機(jī)體對(duì)病原產(chǎn)生反應(yīng)，為疾病系統(tǒng)研究、比較醫(yī)學(xué)研究以及抗病原藥物和疫苗等研制、篩選和評(píng)價(jià)提供的模式動(dòng)物。病原性動(dòng)物模型包括三個(gè)要素：確切的病原、明確的動(dòng)物和充分的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。根據(jù)以上內(nèi)容，除了動(dòng)物模型制備的一般原則，提出制備、建立重點(diǎn)要求以下原則：

1.1 動(dòng)物選擇原則

即從動(dòng)物的種類、遺傳分類、生物學(xué)特性和對(duì)感染性疾病病原被感染程度（敏感性）等方面選擇動(dòng)物。由于感染性疾病病原非常復(fù)雜，有些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染性不強(qiáng)或不能被感染，或新發(fā)感染性疾病病原情況不明時(shí)，可供模型制備的動(dòng)物可擴(kuò)大到實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物，包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和野生動(dòng)物。三類動(dòng)物選擇的優(yōu)缺點(diǎn)分別為：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳背景和微生物、寄生蟲(chóng)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)清楚，環(huán)境條件可以完全控制，影響因素少，結(jié)果準(zhǔn)確，標(biāo)準(zhǔn)化程度高為優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物，尤其是嚙齒類動(dòng)物廣為遺傳改良動(dòng)物，和人遺傳狀態(tài)不同，環(huán)境條件完全不同，病原致病特性也會(huì)不同；經(jīng)濟(jì)動(dòng)物環(huán)境條件類似人類生活環(huán)境，疾病發(fā)生模式非常相近，但是影響因素多，標(biāo)準(zhǔn)化程度高不高；野生動(dòng)物最接近自然，接觸的病原也最多，免疫系統(tǒng)較強(qiáng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)影響的不確定因素非常多，往往帶來(lái)生物安全等問(wèn)題。所以，在病原敏感性相同或接近情況下，動(dòng)物選擇的優(yōu)先順序應(yīng)該是首選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、其次為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物、野生動(dòng)物。

1.2 病原選擇原則

即從感染性疾病病原標(biāo)準(zhǔn)株、代表株、強(qiáng)勢(shì)病原、活化狀態(tài)等方面選擇病原。由于病原是活性生命體，尤其病毒性病原體，非常容易失活，模型制備使用的病原應(yīng)該處于活化狀態(tài)最好的病原。同時(shí)，導(dǎo)致相同感染性疾病的病原在不同地區(qū)存在差異，致病性也會(huì)不同，因此，應(yīng)該選擇生物學(xué)特性明確的經(jīng)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行模型感染研究，以確保得到的疾病模型保持最高真實(shí)性。

1.3 疾病再現(xiàn)最大化原則

即制備的感染性疾病動(dòng)物模型能最大程度的擬似疾病臨床表現(xiàn)、疾病過(guò)程、病理生理學(xué)變化、免疫學(xué)反應(yīng)等疾病特征。這種最大化原則可以是全部完整的擬似，也可以是部分體現(xiàn)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化原則

即模型制備涉及的動(dòng)物、病原、實(shí)驗(yàn)控制、操作程序、標(biāo)本處理、數(shù)據(jù)采集、檢測(cè)指標(biāo)和結(jié)果分析應(yīng)該到達(dá)統(tǒng)一、規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化要求，可實(shí)現(xiàn)模型重復(fù)性好，檢測(cè)指標(biāo)穩(wěn)定，利于客觀、公正和真實(shí)的應(yīng)用。標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)調(diào)制備模型中的各種技術(shù)、劑量和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該固定使用，利于模型的穩(wěn)定重現(xiàn)，因此和病原試驗(yàn)性研究、探索性研究不同。

1.5 生物安全原則

即在病原性動(dòng)物模型制備過(guò)程中，避免經(jīng)病源污染、動(dòng)物接觸、污物擴(kuò)散、樣本采集、意外事件等任何途徑導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室對(duì)人員和環(huán)境的生物危害發(fā)生，嚴(yán)格按照國(guó)家關(guān)于病原微生物相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。病原微生物的實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)必須按照病原危害等級(jí)和防護(hù)要求進(jìn)行。

2 感染性疾病動(dòng)物模型的分類

目前，國(guó)內(nèi)外沒(méi)有嚴(yán)格的感染性疾病模型的分類標(biāo)準(zhǔn)，但是，感染性病原動(dòng)物模型的分類明顯不同于一般動(dòng)物模型的分類，因此，建議按照病原種類特性以及疾病表現(xiàn)程度應(yīng)分為以下一些類型。

2.1 完全疾病表現(xiàn)模型

人源性病原體在動(dòng)物中導(dǎo)致的疾病能全部或基本上擬似人類疾病臨床表現(xiàn)、疾病過(guò)程、病理生理學(xué)變化、免疫學(xué)反應(yīng)等疾病特征。在感染的動(dòng)物中必須能檢測(cè)到活性病原（病原體內(nèi)復(fù)制）和誘導(dǎo)的特異性免疫抗體（機(jī)體改變），這是病原導(dǎo)致疾病的直接證據(jù)，也是模型評(píng)判的根本要素。如一些寄生蟲(chóng)、細(xì)菌病原，宿主特異性不高，或一些人獸共患性病毒性病原能在動(dòng)物上制備的模型。這類模型是最理想的疾病模型，能最大化實(shí)現(xiàn)疾病在動(dòng)物上的再現(xiàn)。

2.2 部分疾病表現(xiàn)模型

人源性病原體在動(dòng)物中導(dǎo)致的疾病能不全部或部分明顯擬似人類疾病臨床表現(xiàn)、疾病過(guò)程、病理生理學(xué)變化、免疫學(xué)反應(yīng)等疾病特征，必須能檢測(cè)到活性病原和誘導(dǎo)的特異性免疫抗體。如一些原蟲(chóng)性寄生蟲(chóng)、細(xì)菌病原，或一些病毒性病原不能在動(dòng)物上表現(xiàn)出完全疾病表現(xiàn)，這類模型也是較理想的疾病模型。

2.3 同類疾病的模型或參比疾病模型

人源性病原體不能在動(dòng)物中直接致病，但本動(dòng)物或其他種類動(dòng)物的相同科、屬、種的病原，或人-動(dòng)物重組病原導(dǎo)致的疾病能全部或部分明顯擬似人疾病臨床表現(xiàn)、疾病過(guò)程、病理生理學(xué)變化、免疫學(xué)反應(yīng)等疾病特征，必須能檢測(cè)到活性病原和誘導(dǎo)的特異性免疫抗體。如動(dòng)物源性寄生蟲(chóng)、細(xì)菌病原，病毒性病原在動(dòng)物上表現(xiàn)出完全類似人類疾病表現(xiàn)，這類模型是較理想的參比疾病模型。

2.4 疾病病理模型

人源性病原體在動(dòng)物中不能導(dǎo)致明顯的擬似人疾病臨床表現(xiàn)、疾病過(guò)程等疾病特征，但病理學(xué)變化非常具有特征性、能在動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)到活性病原和誘導(dǎo)的特異性免疫抗體。如一些寄生蟲(chóng)、細(xì)菌病原，有一定的宿主特異性，或一些病毒性病原常能在動(dòng)物上出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變。這類模型常常成為理想的比較醫(yī)學(xué)用疾病模型，如臨床病人不可能動(dòng)態(tài)取樣了解組織、器官病理改變，而動(dòng)物模型則能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)了解動(dòng)態(tài)變化，為疾病治療等提供依據(jù)。

2.5 病原免疫模型

導(dǎo)入人源性或其他動(dòng)物病原體不能在動(dòng)物中致病，但能引起動(dòng)物全部或部分明顯擬似人疾病免疫學(xué)反應(yīng)等特征。一般檢測(cè)不到活性病原，但能檢測(cè)誘導(dǎo)的特異性免疫抗體。如一些宿主性強(qiáng)的寄生蟲(chóng)、細(xì)菌病原和病毒性病原，不能通過(guò)自然途徑或體表途徑接種感染而在體內(nèi)復(fù)制，但可通過(guò)靜脈、肌肉等免疫途徑導(dǎo)入機(jī)體，機(jī)體通過(guò)處理免疫原的方式產(chǎn)生抗體或細(xì)胞免疫。這類模型嚴(yán)格意義上講不屬于疾病模型，但是考慮到失活病原體成分也可引起類似疾病和免疫反應(yīng)，在沒(méi)有動(dòng)物模型的情況下，也是一種選擇。

2.6 基因工程疾病模型

將病原體的遺傳物質(zhì)（基因）經(jīng)人工方法導(dǎo)入動(dòng)物體基因組中，這些基因的表達(dá)，引起動(dòng)物性狀的可遺傳性修飾，同時(shí)可能導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)病原致病的某些變化而成為模型。這類模型應(yīng)該能檢測(cè)到導(dǎo)入的病原成分和誘導(dǎo)的特異性免疫抗體。這類模型主要針對(duì)一些目前還不能有較理想動(dòng)物模型的寄生蟲(chóng)、細(xì)菌和病毒病原。

2.7 復(fù)合疾病模型

將不同感染性疾病病原感染動(dòng)物，模擬人多重病原感染疾病的臨床表現(xiàn)、疾病過(guò)程、病理生理學(xué)變化、免疫學(xué)反應(yīng)等疾病特征，綜合比較研究病原之間的相互作用。如疾病后期的復(fù)合感染等。

2.8 群體動(dòng)物模型

一群動(dòng)物感染某種病原后，檢測(cè)不到全部動(dòng)物發(fā)病、病原體內(nèi)復(fù)制和出現(xiàn)免疫反應(yīng)，或病原檢測(cè)表現(xiàn)為在不同時(shí)間、不同部位，免疫檢測(cè)時(shí)間不甚一致。此類模型，可通過(guò)計(jì)算群體動(dòng)物發(fā)病百分率來(lái)進(jìn)行應(yīng)用。

2.9 特殊疾病模型

將病原導(dǎo)入免疫缺陷、疾病抵抗、胚胎動(dòng)物、基因工程動(dòng)物等特殊類型動(dòng)物，制備特殊條件下的疾病表現(xiàn)動(dòng)物模型，研究正常動(dòng)物可能不會(huì)或不易檢測(cè)到的疾病改變。

3 感染性疾病動(dòng)模型的局限性

感染性動(dòng)物模型畢竟是利用動(dòng)物，通過(guò)人工方式感染，進(jìn)行模擬研究，尤其是人源性病原體感染動(dòng)物，往往不會(huì)得到和人非常類似的疾病過(guò)程，這也是感染性動(dòng)物模型的局限性，只有認(rèn)識(shí)到這種局限性，才能更好的理解動(dòng)物模型，正確使用動(dòng)物模型。另一方面，也使我們思考，病原為什么在不同動(dòng)物中，表現(xiàn)出致病性的相同或不同，這也是病原性疾病致病機(jī)制研究的重點(diǎn)。概括起來(lái)，感染性動(dòng)物模型的局限性包括以下幾個(gè)方面。

3.1 動(dòng)物的局限

動(dòng)物的種類和等級(jí)的限制等因素影響動(dòng)物模型。不同動(dòng)物遺傳和生物學(xué)特性不同，對(duì)病原的感染性會(huì)有不同表現(xiàn)，不同種屬、品種、品系的動(dòng)物也會(huì)不同，個(gè)體差異也會(huì)影響模型的一致性。如禽流感病毒H5N1，可感染小鼠、大鼠、獼猴、食蟹猴、雪貂等不同動(dòng)物，但其致病性在不同動(dòng)物有所差異，國(guó)外一般推薦使用雪貂作為模型，認(rèn)為疾病過(guò)程和患者類似。但在我國(guó)雪貂尚未實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化，來(lái)源也較困難。動(dòng)物的微生物和寄生蟲(chóng)攜帶情況，即微生物學(xué)等級(jí)，也影響模型制備，一般推薦無(wú)特殊病原體（SPF）動(dòng)物用于模型制備，影響因素較小。另外，動(dòng)物也可能被感染后不會(huì)全部發(fā)病，一般利用整組動(dòng)物感染情況（百分?jǐn)?shù)）作為模型基數(shù)而使用。

3.2 病原的局限

病原的活化程度、來(lái)源、培養(yǎng)、量化、標(biāo)準(zhǔn)病原株、地方株等生物學(xué)特性的差異等因素，會(huì)影響模型的制備。有些病原不能被培養(yǎng)，其他微生物污染干擾等也影響模型制備。病原在動(dòng)物體內(nèi)，受到免疫等阻力，也會(huì)相應(yīng)通過(guò)變異等方式改變生物學(xué)特性。

3.3 實(shí)驗(yàn)方法的局限

方法學(xué)不同或?qū)嶒?yàn)室不具備的方法條件會(huì)影響模型的指標(biāo)確定。很多病原存在不同途徑感染問(wèn)題，想選擇的感染途徑可能不是理想途徑。有些病原需要定量檢測(cè)、病理活檢等實(shí)驗(yàn)室條件達(dá)不到要求，影響模型的完整性。生物安全要求的實(shí)驗(yàn)室條件，和普通實(shí)驗(yàn)室條件下的動(dòng)物模型也會(huì)出現(xiàn)不同，如艾滋病靈長(zhǎng)類模型動(dòng)物（SIV/SAIDS）在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室不會(huì)出現(xiàn)像普通環(huán)境下的后期嚴(yán)重復(fù)合感染情況。

3.4 動(dòng)物和人體的局限

動(dòng)物和人體不同，可能使得病原在不同機(jī)體表現(xiàn)不同。因此，理論上講，和人類遺傳、進(jìn)化越接近的動(dòng)物，可能更能表現(xiàn)出疾病的類似性。但這不是絕對(duì)的，病原和不同動(dòng)物長(zhǎng)期相伴，形成了復(fù)雜的相互關(guān)系，具備了較穩(wěn)固抵抗模式，給模型的制備和疾病分析帶來(lái)極大困難。

3.5 應(yīng)用的局限性

動(dòng)物的質(zhì)量和數(shù)量、病原在體內(nèi)復(fù)制的不確定性、檢測(cè)方法的特異性、敏感性和重復(fù)性、處死動(dòng)物的頻率和要求、藥物和疫苗的特殊要求等等方面都會(huì)影響、限制模型動(dòng)物的應(yīng)用。如靈長(zhǎng)類動(dòng)物不可能像小動(dòng)物一樣要求遺傳均一性和足夠數(shù)量，甚至達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)要求的組（只）數(shù)。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著人類重大感染性疾病的深入研究，相應(yīng)動(dòng)物模型的制備和應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但是，也出現(xiàn)了一些問(wèn)題，如不能準(zhǔn)確理解此類模型的特性和要求等，針對(duì)這些方面的欠缺，本文提出了一些觀點(diǎn)和建議。另外，感染性疾病動(dòng)模型制備應(yīng)該做好充分的準(zhǔn)備，建議重點(diǎn)包括：

4.1 動(dòng)物的準(zhǔn)備

動(dòng)物的選擇準(zhǔn)備是模型制備成功與否的關(guān)鍵。對(duì)于成熟的病原動(dòng)物模型，動(dòng)物的種類、微生物等級(jí)均已明確，應(yīng)該嚴(yán)格按照模型要求制備。對(duì)于初次、新發(fā)病原、新動(dòng)物的模型制備，首先應(yīng)該進(jìn)行動(dòng)物的種類和等級(jí)選擇、感染性確定（病原屬性、劑量、途徑等）等篩選性實(shí)驗(yàn)，也即預(yù)實(shí)驗(yàn)。篩選出敏感、穩(wěn)定的動(dòng)物（種類、年齡、性別等）后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化模型制備。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的倫理和福利原則也應(yīng)得到滿足。

4.2 病原的準(zhǔn)備

病原的活化狀態(tài)和特性是模型制備成功的首要條件。標(biāo)準(zhǔn)病原株、地方株等生物學(xué)特性的標(biāo)準(zhǔn)化確定等也需提前完成。

4.3 方法的準(zhǔn)備

病原感染途徑、劑量、感染環(huán)境控制以及檢測(cè)方法等應(yīng)該是規(guī)范、成熟、穩(wěn)定的。方法、技術(shù)達(dá)不到上述要求，會(huì)在不同程度上影響動(dòng)物模型的一致性。

4.4 檢測(cè)指標(biāo)的準(zhǔn)備

動(dòng)物模型的成功與否，關(guān)鍵體現(xiàn)在模型動(dòng)物的疾病表現(xiàn)和指標(biāo)檢測(cè)，也就是說(shuō)，對(duì)于一種感染性疾病模型，應(yīng)該預(yù)先確定觀察、檢測(cè)哪些表現(xiàn)疾病關(guān)鍵的特征性指標(biāo)，尤其是臨床表現(xiàn)、病原學(xué)指標(biāo)、病理生理性指標(biāo)和免疫學(xué)指標(biāo)以及其他輔助性指標(biāo)的確定。

4.5 模型整體分析準(zhǔn)備

通過(guò)上述疾病表現(xiàn)和指標(biāo)檢測(cè)，明確模型屬于哪類模型，綜合評(píng)價(jià)模型的應(yīng)用程度和范圍等。

4.6 影響因素的排除

在感染性疾病動(dòng)物模型制備過(guò)程中的每個(gè)環(huán)節(jié)，都會(huì)出現(xiàn)影響動(dòng)物模型質(zhì)量的因素，如動(dòng)物因素、病原因素、技術(shù)方法因素、環(huán)境因素等等。因此，力求控制這些影響因素，達(dá)到模型的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化要求，顯得非常重要。

［1］Fouchier R，Kuiken T，Schutten M，et al.Koch’postulates fulfilled for SARS virus［J］.Nature，2003，423：240-241.

［2］Gibbons RJ.Infectiousdiseases［M］.Philadelphia：WB.Saunders Co.，1992.

［3］Paul WE.Fundamental immunology（the 4thedition）［M］.New York：Plenum Press，1998.

［4］秦川.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.

［5］施新猷.人類疾病動(dòng)物模型［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.