盧 群，羅少洪，何偉彬，梅文杰

(廣東藥學(xué)院，廣東廣州 510006)

蟲(chóng)草素是蟲(chóng)草的主要活性成分，具有抗腫瘤、抑菌、抑制病毒、抑制蛋白質(zhì)激酶活性等作用［1－2］。研究證明蟲(chóng)草素能抑制mRNA的合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞分化，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用［1－2］。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及作用靶點(diǎn)已成研究的焦點(diǎn)。為探討蟲(chóng)草素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的新靶點(diǎn)，對(duì)蟲(chóng)草素作用人肝癌Bel-7402細(xì)胞后的抑制和凋亡及p53、Bcl-2表達(dá)變化進(jìn)行研究，尋找蟲(chóng)草素對(duì)人肝癌Bel-7402細(xì)胞抑制的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 蟲(chóng)草素(廣東藥學(xué)院梅文杰教授提供)、人肝癌Bel-7402細(xì)胞(廣東藥學(xué)院陸幸妍副教授提供)、MTT及新生牛血清(美國(guó)Sigma公司)、PRMI 1640(美國(guó) Gibco公司)、p53(博奧森公司)、Bcl-2(Sant Cruz)、酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio SN206976)、熒光顯微鏡(Olympus BX51)、流式細(xì)胞儀(Epics-XL Beckman-Coulter)

1.2 細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn) MTT法檢測(cè)細(xì)胞抑制率。按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率:抑制率/%=(1－實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%

1.3 倒置相差顯微鏡觀察 不同濃度(0、25、50、100 mg·L－1)蟲(chóng)草素作用細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.4 Hoechst 33258染色檢測(cè) 不同濃度(0、25、50、100 mg·L－1)蟲(chóng)草素作用細(xì)胞，Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè) 采用Annexin V聯(lián)合 PI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blot檢測(cè) 采用常規(guī)Western blot技術(shù)檢測(cè)p53、Bcl-2的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組數(shù)據(jù)較采用t檢驗(yàn)，樣本間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞抑制 不同濃度蟲(chóng)草素對(duì)Bel-7402細(xì)胞有明顯的抑制作用，呈濃度時(shí)間依賴性關(guān)系。在25 mg·L－1蟲(chóng)草素作用2 d，抑制率達(dá)49.6%(P＜0.05)。

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài) 不同濃度蟲(chóng)草素作用Bel-7402細(xì)胞2 d有明顯的抑制作用，隨著濃度增加視野范圍內(nèi)細(xì)胞明顯死亡。

2.3 細(xì)胞形態(tài) 不同濃度蟲(chóng)草素作用Bel-7402細(xì)胞24 h，大量細(xì)胞的染色質(zhì)邊集、凝聚、核碎裂、細(xì)胞核固縮及凋亡小體產(chǎn)生。

2.4 細(xì)胞凋亡 0、25、50、100 mg·L－1蟲(chóng)草素作用 Bel-7402細(xì)胞2 d，細(xì)胞凋亡率分別為2.5%、20.6%、27.9%、53.1%，均高于對(duì)照組的2.5%(P＜0.05)。

2.5 基因表達(dá) 50 mg·L－1蟲(chóng)草素作用Bel-7402細(xì)胞，在30 min內(nèi)p53表達(dá)水平增加、24 h后Bcl-2表達(dá)水平下降。

3 討論

蟲(chóng)草素對(duì)Bel-7402細(xì)胞活性呈濃度時(shí)間依賴性抑制，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［3－5］。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示蟲(chóng)草素可引起使凋亡基因p53表達(dá)量增加，而使抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)量下降［6］。

綜上所述，蟲(chóng)草素可明顯抑制Bel-7402細(xì)胞增殖，且誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制是上調(diào)p53、下調(diào)Bcl-2，促進(jìn)細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤細(xì)胞的效果，詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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