劉向云，朱正盛，孫祖越

（上海市計劃生育科學研究所藥理毒理室，中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理檢測中心，上海 200032）

大鼠是常用的實驗動物，其應用十分廣泛，在生物醫(yī)學研究中所用實驗動物中大鼠占20％以上［1］。大鼠尾靜脈注射給藥是動物實驗中常用的給藥途徑，為觀察大鼠尾巴注射局部的藥物反應需制作尾巴標本石蠟切片以供病理診斷。大鼠尾巴為周圍皮膚等軟組織環(huán)繞中心尾骨的結(jié)構(gòu)，作橫切片時若未脫鈣處理，則切片易斷裂破碎且切片刀磨損嚴重；若用硝酸脫鈣液處理，則易損害組織結(jié)構(gòu)，影響染色效果。我室采用鹽酸脫鈣液運用兩種脫鈣方法制作的大鼠尾巴標本石蠟切片完整無破碎，HE染色效果較好，組織結(jié)構(gòu)未可見損壞?，F(xiàn)將制作方法介紹如下。

1 材料和方法

1.1 材料

標本：取自SD大鼠（SD大鼠體重400～450 g，上海BK公司提供［SCXK（滬）2003-0002］。尾巴，橫切0.5 cm左右。

鹽酸脫鈣液：鹽酸8.5 m L、甲酸5 m L、無水三氯化鋁7 g，加入100 m L蒸餾水中［2］。

1.2 方法

A組：大鼠尾巴標本以福爾馬林溶液充分固定后浸入鹽酸脫鈣液中脫鈣，脫鈣液早晚各更換一次，以針刺入尾骨無阻力感為脫鈣終點。脫鈣完成后流水沖洗1 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋直至切片、HE染色。

B組：大鼠尾巴標本以福爾馬林溶液充分固定、流水沖洗后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。修切蠟塊，然后將蠟塊切面向下置于存有鹽酸脫鈣液的培養(yǎng)皿中。標本脫鈣處理時應在培養(yǎng)皿底部襯墊兩層濾紙，以避免蠟塊切面與培養(yǎng)皿底部粘連影響脫鈣液的浸潤。脫鈣3 h即可切出滿意切片，若需切片數(shù)量多可延長脫鈣時間。蠟塊脫鈣后流水沖洗30 min，常規(guī)切片、HE染色。

對照組：大鼠尾巴標本不作脫鈣處理，常規(guī)制片。

2 結(jié)果

2.1 制片時間

A組完成脫鈣需要12～36 h（脫鈣時間與大鼠尾巴標本直徑相關）；B組只需要數(shù)小時，制片周期大大縮短。

2.2 切片質(zhì)量

A、B兩組均能獲得厚薄均勻、完整無破碎的切片，且切片刀磨損較?。粚φ战M切片破碎斷裂、不完整，且切片刀磨損嚴重（封底圖1）。

2.3 染色效果

HE染色后鏡下觀察：組織結(jié)構(gòu)未見破壞，細胞形態(tài)完整，胞核藍染、胞質(zhì)紅染，核漿分明，紅藍適度，A、B兩組切片染色效果無明顯差異；對照組組織破碎不完整，缺失較多，且有脫落的組織碎片沾染于切片上，組織重疊，著色深淺不一（封底圖2、圖3）。

3 討論

未經(jīng)脫鈣處理的尾巴標本，其尾骨質(zhì)脆易碎，切片時破碎且牽拉周圍組織脫落而致切片破裂不完整、缺失較多，標本無法觀察完全，易造成漏診；并且切片組織極易被脫落的碎片沾染，細胞重疊致使閱片時難以準確診斷。這些都影響研究結(jié)論的準確、可信。同時硬質(zhì)的尾骨對刀片有較大磨損，極易使刀片出現(xiàn)缺口，降低切片質(zhì)量。

大鼠尾巴標本石蠟切片制作的關鍵在于脫鈣液的選擇。大鼠尾巴的組織結(jié)構(gòu)決定需要選擇既能迅速充分脫去尾骨鈣質(zhì)又不損害周圍皮膚等軟組織、影響HE染色效果的脫鈣液，同時由于尾骨被周圍軟組織包繞在內(nèi)，阻礙了脫鈣液與尾骨的接觸，遲緩鈣質(zhì)交換，延長脫鈣時間，脫鈣液的選擇更需慎重。硝酸脫鈣液脫鈣迅速但缺陷較大：脫鈣時間難以掌握易嚴重破壞組織細胞細微結(jié)構(gòu)、脫鈣過程中產(chǎn)生二氧化碳分離結(jié)締組織造成組織不完整、易形成亞硝酸使組織黃染影響脫鈣速度且妨礙隨后的染色反應、硝酸在脫鈣的同時酸化組織導致HE染色時細胞核著色欠佳造成染色效果不理想［3］。EDTA脫鈣液對組織無損傷，對組織抗原性的損傷也較小，但脫鈣速度緩慢，需數(shù)周才能脫鈣完畢［4］。本文所用的鹽酸脫鈣液性質(zhì)溫和，脫鈣速度快于EDTA脫鈣液。鹽酸脫鈣液中的甲酸脫鈣速度較硝酸緩慢，但對組織的破壞程度較輕，因而脫鈣時間范圍較廣，脫鈣完成后即使在脫鈣液中繼續(xù)存放1～2 d也不會破壞組織結(jié)構(gòu)。脫鈣液中的鹽酸成分可明顯增加脫鈣速度，它不會使組織膨脹，而是使組織略有收縮。無水三氯化鋁是保護劑，脫鈣液中的鋁離子易被吸附而起到保護作用，同時鋁離子又是常規(guī)HE染色蘇木精等色素的媒染助染劑［5］，可抵消鹽酸對細胞核著色的影響。胥維勇、楊群［6］報道此脫鈣液脫鈣處理標本后可不經(jīng)中和及流水沖洗而直接進入脫水、透明、浸蠟和包埋等后續(xù)制作步驟。故而本文所用鹽酸脫鈣液脫鈣速度較快，脫鈣后染色效果較好，是理想的脫鈣液。

B組所用脫鈣方法是利用酸性溶液能夠穿透石蠟的特性，將常規(guī)包埋塊中的鈣化組織（如鈣化上皮瘤、甲狀腺瘤伴鈣化及肋骨組織等）與脫鈣液直接接觸進行快速脫鈣［7］。大鼠尾骨不是致密骨，骨質(zhì)較為疏松，適于此法進行快速脫鈣。此法脫鈣時間短，數(shù)小時即能切出高質(zhì)量的切片（尾巴直徑較粗者可適當延長脫鈣時間），與A組相比較，制片周期大大縮短。用此法脫鈣，脫鈣液處理組織的時間很短，最大程度減輕了對組織細胞結(jié)構(gòu)的破壞，HE染色效果理想，能保證制片質(zhì)量。因此，推薦 B組脫鈣方法：修切蠟塊，然后將蠟塊切面向下置于存有鹽酸脫鈣液的培養(yǎng)皿中，再切片。

［1］胡建華，姚明，崔淑芳.實驗動物學教程［M］.上海：上海科學技術(shù)出版社，2009：70.

［2］王伯沄，李玉松，黃高昇，等.病理學技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：82.

［3］謝玲，鄒麗宜，張志平，等.改良脫鈣液制作脫鈣石蠟切片與傳統(tǒng)方法的比較［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2008，12（11）：2127.

［4］王伯沄，李玉松，黃高昇，等.病理學技術(shù)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：82.

［5］程敏，王穎，李保泉，等.改良的Gomori特殊染色在口腔硬組織切片中的應用［J］.華西口腔醫(yī)學雜志，2006，24（2）；185 -186.

［6］胥維勇，楊群.脫鈣方法與脫鈣液的選擇及應用［J］.中國組織化學與細胞化學雜志，2002，11（3）：263.

［7］CFA·卡林.組織病理學與組織化學技術(shù)手冊［M］.北京：科學出版社，1982：61-71.