林樹柱，劉先菊，楊 帆，張連峰

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

近年來感染性疾病有了提高的趨勢(shì)，而且傳播速度快、范圍廣。在人類的感染性疾病中有近2/3為人獸共患性疾病，而且這一比例是隨著時(shí)間提高的，在過去的十幾年中，動(dòng)物源性的感染性疾病已經(jīng)席卷了全球［1，2］。哺乳類動(dòng)物與人類關(guān)系密切，是很多人獸共患病病原的宿主、傳播媒介和傳染源。發(fā)展先進(jìn)的動(dòng)物病原檢測(cè)方法，不僅可以有效地保護(hù)動(dòng)物，而且可以防控新發(fā)傳染病。血清學(xué)檢測(cè)是動(dòng)物病原檢疫的重要手段，有著許多不可替代的優(yōu)勢(shì)，而標(biāo)記的動(dòng)物二級(jí)抗體是建立血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)的重要工具，目前全世界都存在著標(biāo)記的動(dòng)物二級(jí)抗體缺乏的問題。為此本研究分離純化了恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長(zhǎng)爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的IgG，免疫大耳白兔制備了兔抗這些動(dòng)物的二級(jí)抗體，并用辣根過氧化物酶（HRP）對(duì)制備的二級(jí)抗體進(jìn)行了標(biāo)記，為這些哺乳動(dòng)物血清學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的建立提供了重要的工具。

1 材料和方法

1.1 17種哺乳動(dòng)物血清IgG的分離純化

取恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長(zhǎng)爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂血，室溫靜置1 h，4℃過夜，4000 r/min離心20 min，得正常血清，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

恒河猴、東北虎、原駝、果子貍、食蟹猴、馬鹿、駱駝、熊猴和雪貂血清5 m L，用生理鹽水等體積稀釋后，再以50％飽和硫酸銨和33％飽和硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀，獲得初步純化血清 IgG。初步純化的樣品再利用HiTrap Protein A HP 5 m L預(yù)裝柱（GE公司）進(jìn)行親和純化［3，4］。

布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、梅花鹿、長(zhǎng)爪沙鼠、大倉鼠、豚鹿和大耳羊血清5 mL，用生理鹽水等體積稀釋后，再以50％飽和硫酸銨和33％飽和硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀，獲得初步純化血清 IgG。初步純化的樣品再利用 HiTrap Protein G HP 5 m L預(yù)裝柱（GE公司）進(jìn)行親和純化［5，6］。

1.2 兔抗17種哺乳動(dòng)物抗血清的制備及二級(jí)抗體IgG的純化

利用親和純的17種哺乳動(dòng)物IgG免疫大耳白兔，制備兔抗這17種哺乳動(dòng)物一級(jí)抗體的抗血清，具體方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［5］。抗血清效價(jià)用瓊脂糖凝膠免疫雙擴(kuò)散方法進(jìn)行測(cè)定［7］。2.5 m L兔抗血清用10 m L PBS（20 mmol/L，pH7.0）稀釋，0.45μm膜過濾，利用GE公司HiTrap Protein A HP 5 mL的預(yù)裝柱進(jìn)行親和層析［8］，純度都經(jīng)SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 兔抗17種哺乳動(dòng)物二級(jí)抗體的 HRP標(biāo)記和標(biāo)記抗體ELISA工作濃度測(cè)定

兔抗17種哺乳動(dòng)物二級(jí)抗體的HRP標(biāo)記采用過碘酸鈉法，具體操作參照文獻(xiàn)進(jìn)行［8，9］。

用直接ELISA法測(cè)定標(biāo)記抗體的工作濃度，先利用親和純化的17種哺乳動(dòng)物的 IgG 10μg/m L，0.1 mL/孔包被 ELISA板，4℃過夜。次日洗滌、封閉，相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體用1％BSA-PBS液依次稀釋成1∶1000、1∶2000、1∶5000、1∶10000、1∶15000、1∶30000、1∶60000，分別加入反應(yīng)孔中，每個(gè)稀釋度二孔，每孔0.1 mL，37℃孵育1 h后洗滌3次，3 min/次。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 m L，37℃反應(yīng)15 min。以2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用ELISA比色儀雙波長(zhǎng)450 nm/630 nm讀取各孔A值。取A值為1.0左右的酶標(biāo)抗體稀釋度作為標(biāo)記抗體的ELISA工作濃度［10］。

1.4 Westernblot方法檢測(cè)標(biāo)記抗體

純化的17種哺乳動(dòng)物IgG利用12％的SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)移至NC膜上，封閉后分別與相應(yīng)的適當(dāng)稀釋的標(biāo)記二級(jí)抗體進(jìn)行孵育，室溫1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，TBS洗膜10 min，與底物反應(yīng)后曝光［10］。

2 結(jié)果

2.1 純化17種哺乳動(dòng)物血清IgG

利用飽和硫酸銨鹽析方法，結(jié)合 Protein A或Protein G親和層析法純化了恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長(zhǎng)爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的IgG，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)其純度達(dá)到了免疫的要求（圖1）。

圖1 親和層析純化哺乳動(dòng)物IgG的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified mammal IgG with Affinity chromatography

2.2 ProteinA純化兔抗17種哺乳動(dòng)物二級(jí)抗體

用純化的恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長(zhǎng)爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的IgG分別免疫大耳白兔4次后，利用瓊脂糖凝膠免疫雙擴(kuò)散的方法檢測(cè)抗血清效價(jià)達(dá)到1∶32以上，取血，制備抗血清，每只兔子得抗血清50 mL左右。

通過Protein A親和層析純化兔抗17種哺乳動(dòng)物抗血清中的IgG，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)在還原條件下呈現(xiàn)清晰的重鏈和輕鏈兩條帶，幾乎沒有其他雜帶。電泳圖未給出。

2.3 ELISA方法鑒定HRP標(biāo)記抗體的效價(jià)

采用過碘酸鈉法對(duì)兔抗17種哺乳動(dòng)物 IgG進(jìn)行了HRP標(biāo)記，并用ELISA方法對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物的效價(jià)進(jìn)行了分析。以 10μg/m L的哺乳動(dòng)物 IgG包被ELISA板，0.1 m L/孔，相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體用 1％ BSA-PBST進(jìn)行系列稀釋，每個(gè)稀釋度二孔，37℃孵育1h后洗滌3次。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液 0.1 m L，37℃15 m in。以 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。在ELISA比色儀上采用450 nm/ 630 nm雙波長(zhǎng)讀取各孔 A值。取A值為1.0左右的酶標(biāo)抗體稀釋度作為標(biāo)記抗體的ELISA工作濃度。結(jié)果如表1所示。

2.4 Westernblotting方法檢測(cè)標(biāo)記抗體

純化的17種哺乳動(dòng)物IgG利用12％的SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)移至NC膜上，封閉后分別與相應(yīng)適當(dāng)稀釋的標(biāo)記二級(jí)抗體進(jìn)行孵育，室溫 1 h，TBST洗膜 3次，10 m in/次，TBS洗膜10 min，與底物反應(yīng)后曝光，結(jié)果顯示標(biāo)記抗體具有很好的特異性。標(biāo)記二級(jí)抗體的稀釋倍數(shù)分別為：兔抗雪貂 IgG-HRP 1∶20000；兔抗恒河猴、虎 IgGHRP 1∶8000，兔抗布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、果子貍、食蟹猴、長(zhǎng)爪沙鼠、豚鹿、熊猴 IgG-HRP 1∶4000；兔抗梅花鹿、駱駝、大倉鼠、大耳羊 IgG-HRP 1∶2000；兔抗原駝、馬鹿 IgG-HRP 1∶1000。Western blot結(jié)果見圖2。

表1 ELISA方法檢測(cè)HRP標(biāo)記的抗體效價(jià)Tab.1 Determination of the titers of the IgG-HRP by ELISA

圖2 Western blot檢測(cè)酶標(biāo)抗體的特異性Fig.2 Determination of the specificity of HRP-IgG of rabbit anti-mammals with Western blot

3 討論

哺乳動(dòng)物是與人類關(guān)系最為密切的物種之一，其作為寵物生活在人類家庭中，與人類日常生活關(guān)系密切，作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物又是人類經(jīng)濟(jì)生活的重要組成部分，是農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，哺乳動(dòng)物還是人類食物的重要來源，有些哺乳動(dòng)物也是科學(xué)工作中重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。由于哺乳動(dòng)物與人類關(guān)系密切，親緣關(guān)系又比較近，所以哺乳動(dòng)物成為了許多人獸共患病的傳播媒介或傳染源［11］，如狂犬病、弓形蟲病等就是由寵物狗、貓等傳染給人類的人獸共患性感染性疾病，流行性出血熱、鼠疫等就是由嚙齒類動(dòng)物傳播的嚴(yán)重的傳染病，布魯氏菌病等是由牛、羊等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物傳播的人獸共患疾病。動(dòng)物疫病的發(fā)生不僅威脅道人類的健康，也會(huì)給國(guó)民經(jīng)濟(jì)帶來重大損失。因此建立有效的哺乳動(dòng)物病原檢測(cè)技術(shù)，控制哺乳動(dòng)物疫病的發(fā)生，對(duì)保障人類的健康和社會(huì)的發(fā)展具有重要的意義。

血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)既可以檢測(cè)正在感染的動(dòng)物，又可以檢測(cè)既往感染的動(dòng)物，而且取材簡(jiǎn)單，在病原檢測(cè)中具有不可替代的作用，因此建立這些動(dòng)物的血清學(xué)檢測(cè)體系對(duì)保障社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人類健康具有重要的意義。標(biāo)記的二級(jí)抗體的缺乏是制約血清學(xué)檢測(cè)體系建立的重要因素，本研究制備了HRP標(biāo)記的兔抗恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長(zhǎng)爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的二級(jí)抗體，結(jié)合之前制備的HRP標(biāo)記的兔抗狗、家貓、豚鼠、金倉鼠、松鼠、花鼠和龍貓等7種寵物的二級(jí)抗體［12］，和HRP標(biāo)記的兔抗家豬，綿羊、山羊、牛、馬、驢、狐貍、貉和黑貂等9種重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的二級(jí)抗體［13］，及 HRP標(biāo)記的兔抗蝙蝠IgG，共計(jì)制備了34種哺乳動(dòng)物的標(biāo)記二級(jí)抗體。這34種哺乳動(dòng)物分別分布在6個(gè)目、10個(gè)科中，既包含寵物、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，也包含恒河猴、食蟹猴、雪貂等重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，還包括東北虎等珍稀動(dòng)物。這個(gè)標(biāo)記的二級(jí)抗體庫的建立，部分的解決了中國(guó)乃至世界范圍內(nèi)的動(dòng)物病原和新發(fā)傳染病病原學(xué)清學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)不完備的問題，為控制動(dòng)物疫病，保障國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展，保護(hù)珍稀動(dòng)物、保證人類健康和應(yīng)對(duì)新發(fā)傳染病做了技術(shù)儲(chǔ)備和資源儲(chǔ)備。

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