宋維芳，徐軍全，馬麗英，連小娟，王明亮，郭明清

（1.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院病理生理學(xué)教研室，汾陽 032200；2.山西省汾陽醫(yī)院感染科肝病區(qū)，汾陽 032200）

肝纖維化是一種損傷愈合反應(yīng)，是慢性肝病發(fā) 展成為肝硬化的必經(jīng)過程，是多種因素參與的、復(fù)雜的、并且在一定程度上可逆的病理過程。瘦素是由ob基因編碼的蛋白類激素，對(duì)機(jī)體能量代謝的調(diào)節(jié)具有重要的作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)瘦素與肥胖、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝異常有關(guān)［1］。最新的研究顯示活化的星狀細(xì)胞瘦素mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)合成均增加［2］，提示瘦素可能與肝纖維化有關(guān)，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transform ing grow thβ1，TGF-β1）是目前已知的最強(qiáng)的促纖維化因子之一，其在肝纖維化過程中主要的作用是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成并抑制其降解，也有間接促星狀細(xì)胞增殖活化作用［3］。為了進(jìn)一步明確肝組織瘦素和 TGF-β1在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了本研究。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及材料

健康清潔級(jí)雌性 W istar大鼠，體重（220±20） g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK（晉） 2010-0001］。四氯化碳為中國(guó)中邦化工分析純；瘦素放射免疫測(cè)定試劑盒購(gòu)于美國(guó) Linco公司；TGF-β1ELISA試劑盒購(gòu)于晶美生物工程有限公司；天狼猩紅和羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2 動(dòng)物的分組及處理措施

44只雌性W istar大鼠，常規(guī)在控光鼠房中分籠普食普水飼養(yǎng)，溫度18℃ ～25℃，濕度45％，1周后，確定所用實(shí)驗(yàn)大鼠健康后，開始實(shí)驗(yàn)。將44只大鼠隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組、模型組1周、模型組2周、模型組4周、模型組6周。正常對(duì)照組給予皮下注射生理鹽水，每周2次（周一和周五注射），其余各組給予首劑5 m L/kg體重CCl4分析純，之后按3 m L/kg體重皮下注射40％CCl4植物油（V/V）混合液，時(shí)間和次數(shù)與正常對(duì)照組同步，各組動(dòng)物按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別于給藥后1周、2周、4周和6周末模型形成后（正常對(duì)照組每次至少相應(yīng)處理3只大鼠），在乙醚麻醉，無菌無熱源條件下，從大鼠腹主動(dòng)脈采血，注入加有肝素（15 U/m L）的無熱源玻璃試管中，4℃離心20 m in（3000 r/m in），吸出血漿置于玻璃試管中封口，于-80℃低溫保存。取肝左葉一部分立即固定于4％多聚甲醛，24 h內(nèi)石蠟包埋，5 μm切片；一部分于-80℃低溫保存。

1.3 檢測(cè)項(xiàng)目與方法

1.3.1 肝纖維化程度的判定 常規(guī)HE染色和天狼猩紅膠原染色、顯微鏡觀察并攝像和李文才等［4］報(bào)道的方法測(cè)定肝組織羥脯氨酸（Hyp）含量以判定肝纖維化的程度。膠原纖維呈紅色，運(yùn)用 Image-pro plus5.0圖象分析軟件半定量計(jì)數(shù)肝組織膠原面積，每組織隨機(jī)取5個(gè)視野，通過比較各組肝組織的纖維化指數(shù)（FI）值評(píng)價(jià)肝纖維化程度［5］。FI=纖維染色區(qū)面積/整個(gè)視野面積×100％。

1.3.2 賴氏法測(cè)定血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）。1.3.3 放射免疫法測(cè)定肝組織和血漿瘦素水平。

1.3.4 雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法測(cè)定肝織組織和血漿TGF-β1含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況及造模效果

實(shí)驗(yàn)過程，正常對(duì)照組大鼠健康狀態(tài)良好，體重增加（100±30）g，肝臟表面光滑，色質(zhì)紅潤(rùn)；模型組大鼠實(shí)驗(yàn)前期出現(xiàn)煩燥、易激惹，約1周后趨于平靜，隨著給CCl4時(shí)間延長(zhǎng)活動(dòng)慢慢減少，精神萎靡，毛發(fā)雜亂無光，食量減少，體重明顯下降，肝臟表面欠光滑，色質(zhì)灰暗，體積變大，邊緣圓鈍。模型組病理切片觀察有較多纖維形成（彩插3圖1B、D）；從2周起模型組肝組織Hyp含量開始顯著升高，后呈遞增趨勢(shì)，6周時(shí)達(dá)最高（表1），提示肝纖維化模型形成。

表1 各組大鼠血漿ALT、肝組織Hyp和FI的變化Tab.1 Changes of plasma ALT，liver Hyp，F(xiàn)I in each group

表2 血漿和肝組織瘦素、TGF-β1的變化Tab.2 Changes of leptin and TGF-β1 in plasma and liver homogenate

2.2 肝組織病理學(xué)變化

HE和膠原染色顯示：光鏡下正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞核多為單個(gè)，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索排列規(guī)則有序，未見變性壞死，肝竇與匯管區(qū)有少量膠原纖維（彩插3圖1A、C）；模型組從1周末就有肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，2周可現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性加重，有輕度的壞死及纖維結(jié)締組織增生，4周末表現(xiàn)為壞死區(qū)及匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生較明顯并成細(xì)小條索，6周末可見匯管區(qū)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維增生明顯加重，呈星芒狀向肝小葉內(nèi)延伸，有假小葉形成（彩插3圖1B、D）。Image-prop lus 5.0圖像分析結(jié)果：FI變化顯示模型組6周時(shí)肝組織中膠原纖維含量比正常對(duì)照組明顯增多（P＜0.05）（如表1）。

2.3 血漿ALT和肝組織Hyp含量變化

從第1周末起模型組ALT和Hyp含量比正常對(duì)照組有顯著升高，模型組ALT第2周末達(dá)高峰，第4至6周又逐漸回降（與2周組比較（P＜0.05），但與正常對(duì)照組相比仍顯著升高（P＜0.05）（表1）；Hyp則呈逐漸升高的趨勢(shì)（表1）。

2.4 血漿和肝組織瘦素、TGF-β1的變化

模型組各時(shí)期血漿和肝組織瘦素均高于正常對(duì)照組，且隨著 CCl4作用時(shí)間的延長(zhǎng)呈梯度上升（表2），與正常對(duì)照組比較，模型組血漿和肝組織TGF-β1含量從4周開始顯著升高，6周達(dá)最高（表2）。

2.5 相關(guān)性分析

肝纖維化過程中：肝組織瘦素含量與 TGF-β1含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.887，P＜0.01）；肝組織瘦素含量與FI呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.754，P＜0.01）；肝組織TGF-β1含量與FI呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.899，P＜0.01）。

3 討論

肝纖維化是大多數(shù)慢性肝病共有的病理過程，是繼慢性損傷后肝組織修復(fù)過程中的代償反應(yīng)，是慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)病理過程，目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制是由于各種原因，使肝細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的沉積和降解的動(dòng)態(tài)平衡打破而造成肝臟基質(zhì)成分改變和數(shù)量的增加，其在一定程度上是一個(gè)可逆的過程。研究發(fā)現(xiàn)各種慢性損害因素引起肝損傷的病理過程中，損害因素可直接或間接介導(dǎo)免疫病理?yè)p傷，從而導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞以及纖維化附近的炎癥細(xì)胞等分泌大量的TGF-β1，同時(shí)TGF-β1又可活化星狀細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)ECM成分的合成，同時(shí)抑制ECM的分解，導(dǎo)致ECM的大量沉積，從而引發(fā)肝纖維化的形成［6-7］。也有報(bào)道 TGF-β1在肝纖維化過程中可活化肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC），還可促進(jìn)膠原基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與沉積，是肝纖維化過程中最重的始動(dòng)因子之一，TGF-β1作用涉及面廣，具有雙向作用，即其正常表達(dá)時(shí)可抑制炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞增殖，異常表達(dá)時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、纖維蛋白的形成，從而促進(jìn)纖維化的發(fā)生和發(fā)展［8］。

瘦素是由ob基因編碼的蛋白類激素，由167個(gè)氨其酸殘基組成，分子量為16×103［9］，通常認(rèn)為瘦素主要是由脂肪細(xì)胞表達(dá)，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)胎盤、肝臟組織和胃組織內(nèi)可產(chǎn)生瘦素，且瘦素的表達(dá)與肝纖維化有著密不可分的關(guān)系［10］，也有研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者血清瘦素水平明顯高于慢性肝炎組，但令研究者困惑的是，該兩組患者瘦素水平卻均低于正常對(duì)照組，并發(fā)現(xiàn)女性患者的血清瘦素水平明顯高于男性，也有研究發(fā)現(xiàn)血清瘦素水平無論男女，均與身體脂肪百分比（BFP）及身體脂肪量（BFM）有顯著相關(guān)性，由此可見影響血清瘦素水平的因素更多是非肝臟來源的，故肝纖維化瘦素血清學(xué)研究存在很大的障礙和局限性。最近有研究者發(fā)現(xiàn)肝組織在纖維化病程中有大量瘦素表達(dá)，由此提示肝組織原位瘦素與肝纖維關(guān)系可能更為直接，故我們通過動(dòng)態(tài)觀察肝纖維化過程中肝組織瘦素、TGF-β1和 Hyp含量變化的同時(shí)輔以血漿相應(yīng)指標(biāo)的對(duì)照研究，并對(duì)肝組織瘦素、TGF-β1和肝纖維化指數(shù)（FI）進(jìn)行了相關(guān)性分析。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，首先HE和膠原染色顯示，模型組有較多纖維形成，證明造模成功；其次我們發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化過程中血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）從模型組1周開始顯著升高，第2周達(dá)最高，后又回降，提示化學(xué)因素CCl4在導(dǎo)致肝纖維化的同時(shí)，可損傷肝功能，且在首次受到打擊時(shí)，可對(duì)肝功能形成強(qiáng)烈的應(yīng)激性損害，后隨著機(jī)體的調(diào)節(jié)，可逐漸適應(yīng)慢性損害，從而顯示出肝功能回降的趨勢(shì)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在肝纖維化過程中肝組織Hyp含呈遞增趨勢(shì)，表明在肝損害過程中肝臟的纖維化修復(fù)一旦激活，將會(huì)持續(xù)進(jìn)行，直至發(fā)生肝損傷的不可逆病變-肝硬化病理過程；最后我們?cè)谘芯康倪^程中，為了排除其它因互對(duì)瘦素和 TGF-β1的影響，直接對(duì)模型組各時(shí)期肝組織瘦素表達(dá)和 TGF-β1水平以及 FI進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)瘦素表達(dá)和TGF-β1水平以及 FI兩兩成顯著正相關(guān)，另不論血漿還是肝組織，瘦素均先于TGF-β1表達(dá)升高，由此我們初步推斷，肝組織原位瘦素水平的是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程的一個(gè)重要始動(dòng)環(huán)節(jié)，并且肝組織原位瘦素水平的升高可能是通過上調(diào) TGF-β1表達(dá)，從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

然而，瘦素在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中的作用有多大，是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，還是一種輔助因素，目前仍然不清，我們今后的實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步研究；還有肝組織原位瘦素在人類慢性肝損傷過程中的作用機(jī)制如何，也是我們今后研究的目標(biāo)。

［1］Berthou F，Rouch C，Gertler A，et al.Chronic central leptin infusion differently modulates brain and liver insulin signaling［J］.Mol Cell Endocrinol，2011，337（1-2）：89-95.

［2］盧建華，劉勇鋼，郎振為，等.慢性乙型肝炎患者肝組織瘦素的表達(dá)［J］.中華傳染病雜志，2007，25：177-178.

［3］Kanzler S，Lohse AW，Keil A.et al.TGF-beta1 in liver fibrosis：an inducible transgenic mouse model to study liver fibrogenesis［J］.Am JPhysiol，1999，276（4）：1059-1068.

［4］李文才，張錦生，李華，等.肝組織羥脯氨酸含量測(cè)定方法的優(yōu)化［J］.上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，27（4）：295-297.

［5］Tanano H，Hasegawa T，Kimura T.et al.Proposal of fibrosis index using image analyzer as a quantitative histological evaluation of liver fibrosis in biliary atresia［J］.Pediatr Surg Int，2003，19（1-2）：52-56.

［6］Kothary PC，Badhwar J，Weng C，et al.Impaired Intracellular Signaling May A llow Up-Regulation of CTGF-Synthesis and Secondary Peri-Retinal Fibrosis in Human Retinal Pigment Epithelial Cells from Patients with Age-Related Macular Degeneration［J］.Adv Exp Med Biol，2010，664：419-428.

［7］Sobrevals L，Rodriguez C，Romero-Trevejo JL，et al.Insulinlike growth factor I gene transfer to cirrhotic liver induces fibrolysis and reduces fibrogenesis leading to cirrhosis reversion in rats［J］.Hepatology，2010，51（3）：912-921.

［8］Ruddell RG，Hoang-Le D，Barwood JM，et al.Ferritin functions as a proinflammatory cytokine via iron-independent protein kinase C zeta/nuclear factor kappaB-regulated signaling in rat hepatic stellate cells［J］.Hepatology，2009，49（3）：887-900.

［9］Zhang Y，Proenca R，Maffei M，et al.Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue［J］.Nature，1994，372：425-432.

［10］盧建華，劉勇鋼，郎振為，等.慢性乙型肝炎患者肝組織瘦素的表達(dá)［J］.中華傳染病雜志，2007，25：177-178.