周開國，何桂珍，董良廣，陳學峰，張 睿

(中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院，北京協(xié)和醫(yī)院腸內(nèi)腸外營養(yǎng)科，北京 100730)

建立大鼠持續(xù)性腸內(nèi)營養(yǎng)的輸注模型和淋巴液引流方法

周開國，何桂珍，董良廣，陳學峰，張 睿

(中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院，北京協(xié)和醫(yī)院腸內(nèi)腸外營養(yǎng)科，北京 100730)

目的 建立大鼠持續(xù)性腸內(nèi)營養(yǎng)的輸注模型和淋巴液引流的方法。方法 大鼠行胃造口后游離硅膠管至背部，通過swivel管連接到微量輸液泵。5 d持續(xù)勻速的輸入腸內(nèi)營養(yǎng)后開腹并游離腸淋巴干，大鼠在腸道缺血60 min再灌注120 min同時潛行插入硅膠管收集淋巴液。結果 第一次胃造口術后大鼠持續(xù)腸內(nèi)營養(yǎng)輸注通暢，未出現(xiàn)死亡或并發(fā)癥狀。第二次手術時通過較簡單的方法可以獲取淋巴液，成功率較高，可達90%以上。結論大鼠持續(xù)腸內(nèi)營養(yǎng)輸注模型的建立，為研究營養(yǎng)物質的作用搭建了一個平臺;通過較簡單的方法獲取淋巴液可以為研究淋巴液的成分提供便利。

大鼠;腸內(nèi)營養(yǎng);淋巴引流

腸內(nèi)腸外營養(yǎng)從上世紀六十年代開展以來，已經(jīng)在國內(nèi)外臨床中得到廣泛的應用。隨著臨床應用的普遍性，研究各種營養(yǎng)物質作用的基礎研究也不斷深入。作為基礎研究的一個重要部分—動物實驗的腸內(nèi)營養(yǎng)持續(xù)輸注模型的建立具有重要的作用。而大鼠淋巴液由于技術難度較高而難以獲得。本課題組建立了大鼠持續(xù)性輸入腸內(nèi)營養(yǎng)的輸注模型，并在大鼠缺血再灌注同時建立較簡單易行且成功率較高的腸淋巴液獲取方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD健康雄性大鼠16只，封閉群，體重(306±9.33)g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［合格證號 SCXK(京)2007-0001］。所有大鼠均飼養(yǎng)于北京協(xié)和醫(yī)院動物中心隔離屏障設施環(huán)境中，溫度18℃ ～29℃，相對濕度40% ～70%，噪聲≤60 dB，人工照明150～300 lx。全部大鼠均單籠飼養(yǎng)，適應性飼養(yǎng)5 d。

1.2 手術物品

剪刀、眼科剪、眼科鑷、有齒鑷、無齒鑷、持針器、縫針、5-0縫線、粗絲線、用于引流和輸注營養(yǎng)液的硅膠導管(內(nèi)徑 ID0.8 mm，外徑 OD1.2 mm，濟南晨光醫(yī)用導管廠)、收集淋巴液的 Nunc凍存管(丹麥Nunc公司)、自制腹腔拉鉤、輸液用 Swivel旋轉軸裝置(instech laboratories，icn.USA，封底圖 1)，無菌操作包內(nèi)還應準備棉簽、紗布、自制老鼠洞巾和固定拉鉤的文具釘，每次手術前所有物品均需滅菌處理。

1.3 腸內(nèi)營養(yǎng)輸注模型的建立

16只大鼠術前均禁食12 h，可自由飲水。稱重后腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)。麻醉滿意后大鼠固定在自制手術木板上，腹部劍突下正中切口，長約2.5 cm.進腹找到胃，在胃底用5-0縫線做一荷包縫合。造口后插入硅膠管，硅膠管在插入前用粗絲線打一死結，插入深度為4～6 cm，收緊荷包，固定硅膠管。從管的另一端注入1.5 mL生理鹽水測試硅膠管是否通暢。硅膠管從腹腔穿出，皮下游離并從后背皮膚穿出，關閉腹腔。硅膠管通過Swivel旋轉軸裝置連接到微量輸液泵。把Swivel旋轉軸裝置固定在背部肌肉或脊柱上。術后約2 h大鼠蘇醒后，開始給予營養(yǎng)液(封底圖2)。營養(yǎng)液的配制為等氮(1.8 g/kg·d) 、等熱量(250 kcal/kg·d)，所有營養(yǎng)液在無菌操作的條件下配制。用微量注射泵24 h勻速輸注，輸注速率為2 mL/h，第一天給與半量。每次更換營養(yǎng)液時用1 mL生理鹽水沖洗管道。大鼠可以在代謝籠中自由活動，記錄術中和術后發(fā)生的不良反應以及是否出現(xiàn)死亡現(xiàn)象、老鼠精神狀態(tài)和給予營養(yǎng)5 d前后的體重。

1.4 淋巴液引流

16只大鼠持續(xù)在給予營養(yǎng)液5 d后行第二次手術。開腹前步驟和第一次手術相同，切口選擇偏下方長度約3 cm，進入腹腔后，用棉簽把腸道輕柔的撥向大鼠左側。在右腎動脈水平可以找到腸系膜上動脈。在其上方可以發(fā)現(xiàn)一根呈乳白色腸淋巴干。在近腹主動脈處小心分離漿膜，鈍性分離腸系膜上動脈及腸淋巴干。分離腸淋巴干后在近心端剪一小口，將導管一端剪成45°，緩慢斜向下輕送進3～5 mm，然后用少量醫(yī)用膠(北京福愛樂科技發(fā)展有限公司)涂抹在插入口、右腎旁漿膜處以及腹腔切口右側固定導管，以防脫出。導管另一端插入預先已在管蓋鉆一小孔的Nunc管(封底圖3)。缺血再灌注是課題研究需要，因本課題組主要研究腸道缺血再灌注時淋巴液中生物活性物質的變化及對遠隔組織的影響。所以建立淋巴引流的方法。在硅膠管插入淋巴干后用無創(chuàng)血管夾夾住腸系膜上動脈，夾閉60 min后松開夾子復灌120 min。為防止松夾時出現(xiàn)一過性低容量反應，所有大鼠在缺血再灌注過程中均在腹腔開口處蓋上用生理鹽水濕潤的無菌敷料(封底圖4)，間斷給與生理鹽水。記錄術中術后發(fā)生的不良反應以及插管成功率和3 h引流量。

2 結果

2.1 動物觀察

第一次胃造口手術后，所有老鼠均未出現(xiàn)腹腔切口感染，腸粘連，出血等并發(fā)癥，未有死亡現(xiàn)象。給與營養(yǎng)后精神狀態(tài)良好，腹部后背體毛逐漸長出，傷口愈合佳。持續(xù)5 d連續(xù)營養(yǎng)液輸液后體重較前有不同程度上升。

2.2 淋巴液引流

在大鼠腸道缺血再灌注同時采用較簡單易行的淋巴液獲取方法。在熟練掌握獲取方法后，淋巴引流的成功率較高(15/16，93.8%)，3 h淋巴引流量為0.6～1.0 mL。引流的淋巴液進一步測定其內(nèi)毒素和炎性因子的濃度，并與正常大鼠進行對照。

3 討論

大鼠的腸道特征(解剖、代謝甚至生化)與人的相似［1］，并且大鼠腸道對脂溶性物質的吸收也與人相似［2］。所以大鼠是作為營養(yǎng)研究的理想動物。目前認為腸道是多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS) 的發(fā)動機［3］，其可能是獨立的腸源性的因子經(jīng)“腸—淋巴”途徑到達系統(tǒng)循環(huán)導致系統(tǒng)性炎癥反應綜合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)和遠隔組織器官損進而引起 MODS［4］，因為淋巴是一個重要途徑，淋巴引流研究其成分是一個重要的研究手段。但以往的淋巴引流多集中在胸導管，且操作復雜，解剖難度大，一些顯微操作器械不是每個實驗室都可以具備，所以建立相對簡單的腸道淋巴液引流方法對研究淋巴液中成分是必需的。

動物手術時要嚴格遵守無菌操作的步驟。腸內(nèi)營養(yǎng)輸注模型建立中應該注意：①實驗動物應安全麻醉，術后能及時清醒。②胃造口時硅膠管插入前用粗絲線打的結不能太緊也不能太松，太緊則輸注營養(yǎng)液困難，太松則不能起到增大摩擦的作用，插管容易從造口中滑出。③管插入深度原則上是寧長勿短，短容易滑出造口。④因為大鼠皮膚比較松弛，要保證大鼠能在代謝籠中自由活動，所以Swivel旋轉軸裝置應該固定在肌肉或脊柱上。⑤每次更換營養(yǎng)液時應用注射器輸注1 mL生理鹽水做通管用以防堵塞。⑥輸注營養(yǎng)液出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象時可以用10 mL注射器高壓通管。

淋巴液引流時應該注意：①鈍性分離腸系膜上動脈及腸淋巴干漿膜時必須操作仔細，不需要完全分離腸系膜上動脈及腸淋巴干。有研究報道完全分離與不完全分離對插管成功率沒有差別［5］。②腸系膜淋巴管位置相對表淺，管壁特別薄，僅由多層上皮細胞組成，很容易撕裂。游離一小段即可。③剪口盡量選擇在近心端，因為如果近心端插入失敗，還有遠心端可以選擇。④腸淋巴管的位置多與腸系膜上動脈平行在其上側，但是騎跨的情況并不少見，甚至還可以在腸系膜上動脈后方，與彭等的報道一致［6］。⑤插入的硅膠管應與淋巴管成平行，所以固定硅膠管時應有此概念。

本實驗插管成功率較以往報道稍高，可能由于插管難度不一，以致影響插管質量而導致的差異，也有大鼠之間個體差異的原因。本方法所需器材相對簡單，實驗室容易添置。所需人力要求不高，一人足以完成。這是此方法優(yōu)勢所在。

飲食對淋巴液的流量有明顯影響，禁食超過4 h時會影響淋巴的量，而本實驗因完全按照臨床手術規(guī)范行事，禁食時間較長，這影響淋巴液的引流量。相比國內(nèi)外報道的淋巴引流量偏少。國外 Boyd［7］報道的淋巴液引流量較大，可能與其術前1 h應用1.5～2 mL橄欖油，術中輸液有關。還與其是從胸導管引流淋巴液有關，因為胸導管的淋巴淋量占全身的50% ～70%，而本實驗采用的是腸淋巴干引流。

目前隨著醫(yī)學基礎研究的范圍越來越廣，研究深度也在不斷加深。持續(xù)腸內(nèi)營養(yǎng)輸注模型的建立和淋巴液獲取方法的簡便化可以為研究疾病與營養(yǎng)物質的作用機制提供一個良好的技術平臺。

［1］ Desesso JM，Jacobson CF.Anatomical and physiological paraeters affecting gastrointestinal absorption inhumans and rats［J］.Food Chem Toxicol，2001，39(3)：209-228.

［2 ］ Pahl MV，Oveisai F，Khamisech G，et al.Intestinal absorption and billary secretion of cholesterol in rats with nephritic syndrome［J］.Nephrol Dial Transplant，1998，13(6)： 1446-1451.

［3］ Clark JA，Coopersmith CM.Intestinal crosstalk：a new paradigm for understanding the gut as the“motor”of critical illness［J］.Shock.，2007，28：384-393.

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［7］ Boyd M Risovic V Jull P，et al.A stepwise surgical procedure to investigate the lymphatic transportoflipid-based oraldrug formulations：Cannulation of the mesenteric and thoracic lymph ducts within the rat［J］.Pharmacol Toxicol Method，2004 ，49(2)：115-120.

Model Establishment of Continuous Infusion of Enteral Nutrition and a Method for Obtaining Lymph in Rats

ZHOU Kai-guo，HE Gui-zhen，DONG Liang-guang，CHEN Xue-feng，ZHANG Rui
(Department of Enteral and Parenteral Nutrition，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China)

Objective To establish model of continuous infusion of enteral nutrition and a method for obtaining lymph in rats.Method After rats received gastrostomy，the silicone tube，which freed to post back，was connected to the micro infusion pump through the swivel.After 5 days of continuous enteral nutrition the rats were opened the abdominal cavity and freed the intestinal lymph trunk，then the rats was subjected to intestinal ischemia for 60 minutes and reperfusion for 120 minutes，meanwhile，stealth inserted the silicon tube to collect lymph.Result After the first operation，the continuous infusion of enteral nutrition was smooth in rats and there were no death or complications symptoms.The lymph fluid was obtained by a simpler method，which success rate was higher than 90%in the second operation.Conclusion Model establishment of continuous infusion of enteral nutrition in rats could greatly facilitate to study the role of nutrients.The simple method to obtain the lymph provides greatly convenience for the study of lymph ingredients.

Rats;Enteral nutrition;Lymphatic drainage

R332

A

1671-756(2011)03-0049-03

2010-06-22

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.012

國家自然基金資助項目(30940069)。

周開國(1985-)，男，研究生。

何桂珍 ，教授，研究生導師，研究方向：臨床營養(yǎng)。E-mail：hgzpumc@163.com。