張 娟（綜述），袁 俐（審校）

結核分枝桿菌原核泛素樣蛋白的研究進展＊

張 娟（綜述），袁 俐（審校）

結核病是人類致死的主要感染性疾病之一。盡管人體內存在有效的控制結核桿菌生長的機理，大部分人感染結核分枝桿菌后，不會發(fā)展成結核病，但是結核桿菌在機體中很難被消滅［1］。近年來，隨著Pup（Prokaryotic ubiquitin－like protein）的發(fā)現(xiàn)及其功能的深入研究，為制定結核病患者的治療策略提供了新的依據(jù)。本文簡要介紹結核分枝桿菌Pup的發(fā)現(xiàn)、結構特點以及Pup修飾系統(tǒng)中所涉及的酶等一些最新進展。

1 Pup的發(fā)現(xiàn)

早在上世紀70－80年代，研究人員從小牛的胰臟中發(fā)現(xiàn)了泛素，其參與蛋白水解過程，在很多基本的細胞過程中都起很重要的作用。以色列科學家阿龍·切哈諾沃、阿夫拉姆·赫什科和美國科學家歐文·羅斯發(fā)現(xiàn)了泛素調節(jié)的蛋白降解過程，為從分子水平上理解細胞控制一些非常重要的生化過程成為了可能，因此在2004年被授予諾貝爾化學獎。但是，直到2008年年底，瑞士聯(lián)邦理工學院分子生物學與生物物理學研究所Eilika Weber－Ban所帶領的研究團隊才在結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的、被稱作Pup的小蛋白，它可以附著到其他蛋白質上決定該蛋白命運，進而清理蛋白質，控制或調節(jié)細胞內其他重要的生理過程［2］。

2 Pup及結構特點

在真核生物中，通常利用泛素化對標記的蛋白質進行蛋白酶體降解。近年來，發(fā)現(xiàn)細菌中也存在著類似的標記系統(tǒng)。結核分枝桿菌的Pup是非真核生物中發(fā)現(xiàn)的第一個類泛素蛋白。類泛素蛋白是一類小分子蛋白質，它們不僅在結構上與泛素相似，而且也可以共價連接到其他的蛋白質上對其進行共價修飾［3］。

Pup是由64個氨基酸殘基組成的內在無序的蛋白，Pup蛋白的編碼基因位于Rv2111c。Pup可以在結核分枝桿菌菌體內對一些特定蛋白進行修飾，使他們被菌體內的蛋白酶體所降解。Pup既不是β－grasp蛋白也不是類泛素蛋白，它通過C末端的谷氨酰胺位點與靶蛋白的賴氨酸位點相連。Pup末端的谷氨酰胺在與靶蛋白連接時或連接之前會變?yōu)楣劝彼帷?/p>

雖然真核生物中的各種類泛素蛋白在序列上的相似性比較低，但它們的三維結構卻高度保守，都呈現(xiàn)典型的類泛素折疊模式［4－5］。涂曉明等人研究發(fā)現(xiàn)，與其它類泛素蛋白超家族的成員相比，Pup不但在序列上相似性很低，在結構上也呈現(xiàn)出完全不同的折疊方式。借助結構預測并結合圓二色（CD）和核磁共振（NMR）等手段，證明Pup是一個內在無序蛋白（intrinsically disordered protein，IDP）。更進一步，利用化學位移編輯（CSI）和異核｛1H｝－15N NOE方法，確認在Pup的C端有殘余的二級結構。在研究中，還用表面等離子共振（SPR）確證了Pup與結核分枝桿菌蛋白酶體ATP酶（mycobacterium proteasomal ATPase，Mpa）的相互作用，并利用NMR微擾的方法檢測了Pup上參與相互作用的區(qū)段。結果顯示Pup很可能通過其C端的30－59區(qū)段利用疏水相互作用與Mpa結合。另外，系統(tǒng)進化分析清晰地表明，Pup屬于一個獨特的、趨異的進化分支，是類泛素蛋白中分支最早、最深的一個家族［6］。

3 參與Pup修飾的酶系統(tǒng)

3．1 Pup脫酰胺酶（Dop）的脫酰胺作用 在真核生物中，靶蛋白通常會被多泛素鏈標記［7－9］。復雜的調控系統(tǒng)與蛋白酶體有關，可以識別多泛素鏈，也可以為其他的泛素化修飾過程轉移和再循環(huán)泛素單體［10］。目前，對于Pup是否形成泛素鏈，是否與泛素蛋白類似，是否可以再循環(huán)等未見報道。

而泛素蛋白與Pup蛋白有一個共同的特征，在他們的C－羧基端，都存在一個雙甘氨酸序列（Gly－Gly）。泛素蛋白通過C端的甘氨酸羧化物與靶蛋白的賴氨酸結合。與泛素蛋白不同的是，Pup通過C端的谷氨酰胺（Q，Gln）的羧化物與靶蛋白賴氨酸結合。實驗中通過質譜研究發(fā)現(xiàn)，Pup結合靶蛋白時，并不需要蛋白水解C端的GGQ序列。質譜分析結果表明Pup－靶蛋白片段比理論計算的GGQ序列大1Da，這應該是C端谷氨酰胺的脫酰胺作用造成的，也就是說，C端谷氨酰胺的脫酰胺作用是Pup結合靶蛋白的先決條件［11］。

研究人員在試管內模擬Pup結合到蛋白質上的方式時發(fā)現(xiàn)了一種Pup脫酰胺酶（deamidase of Pup，DOP）（編碼基因位于Rv2112），并證實在結核分枝桿菌中，Dop酶作為一種特殊的Pup脫酰胺酶，在Pup與靶蛋白結合之前，可以脫去C端的谷氨酰胺基［12］。Striebel等人發(fā)現(xiàn)Dop與泛素修飾過程中的E1酶、E2酶和E3酶沒有同源性。生物結構分析表明Dop和蛋白酶體輔酶因子（proteasome associated factor，Paf A）很可能屬于羧化物－氨連接酶超家族，類似于γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶［10］。這個家族的酶催化連接反應，包括磷酸化一個與氨連接的羧化物，導致一個酰胺連鎖反應。而脫酰胺作用需要ATP作為輔助因子并不是它的分解作用。在生物體中，脫酰胺作用可能作為一種調控機制，使Pup終止于谷氨酰胺。該結果為針對肺結核患者，尤其是病原體已產(chǎn)生抗生素耐藥性的患者制定治療策略提供了新依據(jù)。

3．2 Paf A 的結合作用 Pearce［2］等人研究發(fā)現(xiàn)，Pup與結核桿菌蛋白酶體的通路有關，Pup與賴氨酸共價結合在特定的蛋白上，比如FabD，F(xiàn)ab D的泛素化導致它的降解，這種蛋白類似于真核生物的泛素結合蛋白。這種標記的結合反應，被發(fā)現(xiàn)依賴于另一種分枝桿菌蛋白—蛋白酶體輔酶因子Paf A（Rv2097）［13－14］。

因為Paf A與γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶具有同源性，并且研究發(fā)現(xiàn)，在結核分枝桿菌Paf A突變株中，未能檢測到被Pup標記的蛋白，Paf A可能與Pup和底物連接有直接的關系。Lyer［15］等人研究證明Paf A是Pup的連接酶，Paf A能使脫酰胺作用后的Pup與靶蛋白結合。

Frank Striebel研究發(fā)現(xiàn)［12］，Dop酶和Paf A酶可以催化獨立的反應。Dop酶催化Pup蛋白的C－谷氨酰胺的脫酰胺過程，使Pup－GGQ轉化成Pup－GGE，這一過程需要ATP作為輔助因子。而Paf A催化Pup－GGE與靶蛋白的結合過程，異肽鍵的形成需要ATP水解成ADP。Pup的脫酰胺過程和Pup與靶蛋白的結合過程是獨立的，不相互影響。

3．3 Dop和Paf A的同源性 為了尋找與Pup相互作用的蛋白質，從而進一步理解Pup的功能，F(xiàn)rank Striebel［12］等人利用下拉實驗，結合質譜法，胰蛋白酶消化等實驗顯示Dop、Paf A和Mpa作為Pup蛋白的關聯(lián)配偶體。在下拉式實驗中，也證實Dop是Paf A的同源蛋白（32%相同，50%同源）。

基因組分析顯示，Paf A是由含有61個堿基的開放讀碼框所編碼，其中的59個堿基包含編碼Dop的開放讀碼框。這些蛋白經(jīng)多序列排列顯示出在大約27個氨基酸后，N端存在一個標記序列，從而可以把Dop簇從Paf A簇中分離出來。而這兩個蛋白簇在90－300個氨基酸的區(qū)域，顯示高的同源性。相反，在300－500個氨基酸的區(qū)域，顯示適中的同源性，并且只有Dop蛋白有C末端伸展。由于較長的N端序列和C末端伸展，大體上，Dop蛋白會比它的同源蛋白Paf A長大約50個氨基酸。

總而言之，兩個同源的蛋白Dop和Paf A都存在于結核分枝桿菌基因組中，但是功能不同。

3．4 Mpa 蛋白酶系統(tǒng)普遍存在于古細菌和真核生物中，近年來發(fā)現(xiàn)，也存在于一些放線菌屬中［16］。類似于真核生物，結核分枝桿菌蛋白酶體系統(tǒng)包含一個20S蛋白酶體和Mpa，它們與真核生物的類似物相同，在結構上高度保守［17－19］。在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，Mpa蛋白水解酶體系統(tǒng)對于結核分枝桿菌導致的致死性感染是至關重要的［20］。

Mpa包含一個N端螺旋結構域和一個可以調控多領域活性的ATP酶結構域，形成六聚物［19，21］。Mpa的結構與其他的ATP酶－蛋白水解酶體一樣，都含有古細菌屬中能激活蛋白酶體的核苷酸酶PAN和紅球菌屬中環(huán)形ATP酶復合物ARC［22－23］。

Pup通過C端的谷氨酸鹽與底物的賴氨酸形成異肽鍵，與底物共價結合。在這一結合過程的產(chǎn)物中，發(fā)現(xiàn)部分PupC端與Mpa相互作用，而部分N端則促進底物的伸展和降解［24－25］。因而與Pup結合的底物可能被轉移給蛋白酶體，這一過程通過Mpa特異性的識別Pup來完成的，但關于調控Mpa識別Pup的分子機制仍不清楚。

Tao Wang［26］等人運用生物化學和基因遺傳方法，分析了Mpa的晶體結構和Pup與Mpa結合的共價晶體結構，發(fā)現(xiàn)Pup最初結合底物時是未折疊狀態(tài)；無規(guī)則的Pup以Mpa螺旋為模版，折疊成α螺旋；與Pup結合的底物蛋白，在ATP水解的條件下，被拉成ATP蛋白酶體的中心管。研究人員建立了結核分枝桿菌Pup介導的蛋白酶解模型，提出了底物蛋白結合Pup蛋白水解酶體的機制，并提出折疊的Pup被誘導的結合反應對于蛋白降解的是必需的。

Pup和ATP蛋白水解酶體在序列上的高度保守，以及折疊Pup被誘導的結合反應，作為一種普遍的識別機制，存在于細菌的蛋白酶體系統(tǒng)中。Pup與Mpa的相互作用在細菌中是獨特的。細菌與真核生物蛋白酶體系統(tǒng)存在的差異，為我們開發(fā)一種特殊的結核分枝桿菌蛋白酶體抑制劑，作為結核病的分子治療方法，提供了依據(jù)。

4 展 望

目前，Pup在結核分枝桿菌中的研究仍處于起步階段。瑞士聯(lián)邦理工學院研究人員發(fā)現(xiàn)，雖然細菌和人類的標記蛋白在功能上都是確保細胞蛋白質的降解，但它們的結構和作用方式卻明顯不同。由于細菌中的蛋白標記系統(tǒng)與人體不同，因此針對細菌Pup系統(tǒng)的藥物對人類副作用很?。?6］。

結核分枝桿菌中依賴ATP酶的蛋白水解酶體系統(tǒng)Mpa在調控蛋白活性和定位中發(fā)揮著重要的作用。對Pup的分子機制特別是Pup的結構、Pup修飾酶的識別等方面已經(jīng)有了初步了解。然而對Pup的理論研究及應用情況還了解甚少。深入研究Pup的作用機制和對結核分枝桿菌的分子治療方法帶來新的希望，開發(fā)特殊的結核分枝桿菌蛋白水解酶體抑制劑，將成為可能。

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A

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2011－05－13