陳春霞（綜述），闞 飆（審校）

MLVA技術(shù)在沙門菌分型和分子流行病學(xué)研究中的應(yīng)用

陳春霞（綜述），闞 飆（審校）

沙門菌屬是屬于腸桿菌科的一類生化特性、抗原結(jié)構(gòu)和DNA同源性等相關(guān)的革蘭陰性菌，廣泛存在于自然界，能引起多種動(dòng)物感染。人源感染主要是通過污染食物從而引起的食物中毒。目前沙門菌感染是全球范圍內(nèi)最常見的食源性疾病之一［1］。全球每年估計(jì)發(fā)生13億因沙門菌導(dǎo)致的急性胃腸炎病例，其中300萬患者死亡［2］。在美國，估計(jì)沙門菌所致感染占所有由食源性致病菌引起感染的26%［3］，每年沙門菌感染的有140萬病例，引起17 000人住院并且將近600人死亡［4］，導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失每年約為24億美元［5］。我國沙門菌感染的情況也很嚴(yán)重，多年來一直居細(xì)菌性食物中毒的首位（占64%），2005年共發(fā)生沙門菌食物中毒24起，1 358人中毒，其中死亡2人［6］。

對菌株進(jìn)行分離和分型是用于疾病常規(guī)監(jiān)測、流行病學(xué)研究、暴發(fā)調(diào)查和溯源追蹤的一種重要的工具，而不是僅僅為了感染性疾病的病原學(xué)診斷。多位點(diǎn)的可變串聯(lián)重復(fù)（VNTR）分析是近年發(fā)展起來的以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子分型方法，由于其操作簡單、快速、可重復(fù)性好、分辨率高并且不同的實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果易于比較等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于多種細(xì)菌的分子分型［7］。國際病原菌分子分型實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)（PulseNet）已將MLVA列為第二代分子分型方法［8］，其中沙門菌中的鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌在PulseNet中已經(jīng)分別確立了標(biāo)準(zhǔn)化方案。本文就MLVA技術(shù)及其在沙門菌流行病學(xué)研究和分析中的應(yīng)用作綜述。

1 用于MLVA分析的VNTR位點(diǎn)的篩選

MLVA中VNTR（可變數(shù)目序列重復(fù)），由串聯(lián)重復(fù)的單一DNA原件組成［9］。許多細(xì)菌基因組DNA都含有重復(fù)序列，這些重復(fù)序列是以多拷貝形式存在在全基因組上。同一種屬的不同的單個(gè)細(xì)菌常常含有相同的重復(fù)序列但是串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目不同，而串聯(lián)重復(fù)序列的兩側(cè)側(cè)翼區(qū)域在不同的單個(gè)菌株中顯示序列同源性，因此在重復(fù)序列的側(cè)翼區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR產(chǎn)物的長度，可以推導(dǎo)每一個(gè)位點(diǎn)的重復(fù)單位數(shù)目，從而確定串聯(lián)重復(fù)單位的拷貝數(shù)的變異情況，可以反映不同菌株的遺傳多樣性。

細(xì)菌全基因組序列測序已經(jīng)大大推進(jìn)了識別用于菌株分型的VNTR的方式，從而為重復(fù)DNA的評價(jià)和對流行病學(xué)調(diào)查的應(yīng)用開辟了道路。通過應(yīng)用能夠快速掃描全基因組的軟件，VNTR位點(diǎn)能夠迅速的被定位，PCR引物可以根據(jù)側(cè)翼序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。目前用于篩選VNTR位點(diǎn)的常用軟件包括TRF（http：//tandem.bu.edu/trf/trf.html）［10］和TRD（http：//minisatellites.u－psud.fr）［11］。對于這兩個(gè)軟件產(chǎn)生的串聯(lián)重復(fù)位點(diǎn)都可以用免費(fèi)在線軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（www.biotools.umassmed.edu/biopass/primer3＿www.cgi）。需要強(qiáng)調(diào)的是這兩個(gè)軟件篩選出來的某種細(xì)菌基因組的位點(diǎn)，在不同菌株中大多數(shù)可能有非常低的或者沒有多態(tài)性，因此每一個(gè)位點(diǎn)在用于基因分型之前，應(yīng)當(dāng)選擇一組遺傳學(xué)無關(guān)的菌株對位點(diǎn)重復(fù)數(shù)的多態(tài)性進(jìn)行評價(jià)［11］。

2 MLVA在沙門菌菌株分型和分子流行病學(xué)中的應(yīng)用

2.1 菌株分子分型 在沙門菌感染流行中，對菌株進(jìn)行準(zhǔn)確的分子分型，對發(fā)現(xiàn)暴發(fā)和尋找感染源頭以及控制傳播是很重要的。Bj?rn－Arne Lindstedt等［12］在2003年篩選了8個(gè)VNTR位點(diǎn)對78株分離自1993－2002年的鼠傷寒沙門菌尤其是其中的噬菌體DT104型菌株進(jìn)行DNA指紋圖譜研究，將78株菌分成了54種VNTR帶型，其中37株噬菌體DT104型菌株發(fā)現(xiàn)有28種不同的VNTR帶型。這種VNTR方法與XbaⅠ－PFGE、AFLP、整合子基因圖譜和四種基因的PCR方法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示了VNTR方法具有分辨率高、簡單快速、重復(fù)性好、結(jié)果易于解釋和可以完全自動(dòng)化分析等多種優(yōu)點(diǎn)，隨后MLVA方法用于多種沙門菌血清型的基因分型的報(bào)道也越來越多［13］，并且展示了非常好的分型結(jié)果。Liu等［14］應(yīng)用3個(gè)VNTR位點(diǎn)用多重PCR方法對來自新加波、印度尼西亞、印度、孟加拉、馬來西亞和尼泊爾等幾個(gè)亞洲國家的傷寒沙門菌進(jìn)行分子分型，59株菌被分成了49種不同的型別，并且同一個(gè)國家內(nèi)和不同國家間的菌株也都顯示高水平的VNTR圖譜異質(zhì)性，提示了這種基于3個(gè)VNTR位點(diǎn)的方法具有高度的分辨率，能夠?yàn)閭抽T菌的流行病學(xué)分析提供了非常有用的信息。Malorny等［15］報(bào)道了一種新的具有高分辨率的MLVA方法用于腸炎沙門菌的分型，應(yīng)用9個(gè)位點(diǎn)的MLVA方法對240株分離自人、動(dòng)物、食品和環(huán)境的包含23中噬菌體型的腸炎沙門菌進(jìn)行分析，共分成79種不同的MLVA型，MLVA的Simpson多樣性指數(shù)在研究的菌株樣本中是0.919。研究中62株腸炎沙門菌噬菌體PT4型菌株分成了24種MLVA型，81株腸炎沙門菌噬菌體PT8型菌株分成21種型，因而這9個(gè)位點(diǎn)的MLVA方法是非常有用的用于區(qū)分腸炎沙門菌尤其是單一的噬菌體型菌株。Davis等［16］用6個(gè)位點(diǎn)的 MLVA方法將132株紐波特沙門菌菌株分成40種不同的型別，每一種型別的菌株數(shù)目從1－26不等，Simpson多樣性指數(shù)是0.91，略高于PFGE。MLVA的高分辨率和能夠更快的獲得結(jié)果使得其成為紐波特沙門菌區(qū)域監(jiān)測和暴發(fā)調(diào)查的強(qiáng)大的補(bǔ)充或替代的技術(shù)。Tien等［17］比較了PFGE和MLVA兩種分型技術(shù)用于甲型副傷寒沙門菌的分子分型，XbaⅠ－PFGE和BlnⅠ－PFGE兩種酶的組合將55株菌分離自南亞和東南亞的至少6個(gè)國家的跨越10年時(shí)間的甲型副傷寒菌株分成14種型，分辨指數(shù)（DI）是0.741，同樣的菌株，基于6個(gè)VNTR位點(diǎn)的MLVA方法能將其分成23種型別，分辨指數(shù)是0.937，顯著高于PFGE，因此認(rèn)為MLVA能獲得明確的數(shù)據(jù)，是高通量的并且具有較高的分辨率，能夠成為一種選擇的分型方法補(bǔ)充PFGE用于甲型副傷寒沙門菌的流行病學(xué)調(diào)查。Bergamini等［18］發(fā)展了6個(gè)位點(diǎn)的 MLVA方案用于分析55株雞沙門菌，并且將其結(jié)果與3種酶切（XbaⅠ、SpeⅠ和XhoⅠ）的PFGE進(jìn)行比較，MLVA將55株菌分成21種型，3種酶的PFGE的組合將其分成18種型，顯示MLVA的分辨率同等于3種酶的PFGE組合，但是MLVA方法易于操作，結(jié)果解釋更加直觀明了。這些研究都充分展示了MLVA方法在沙門菌的分型和監(jiān)測方面具有廣闊的應(yīng)用前景，為沙門菌的監(jiān)測及防治提供了最有利的手段。

2.2 流行病學(xué)調(diào)查 傳染病的流行病學(xué)調(diào)查，在某種程度上，依賴于實(shí)驗(yàn)室特征描述或分型數(shù)據(jù)。菌株分型通過從散發(fā)病例中區(qū)分暴發(fā)相關(guān)的病例，證實(shí)涉嫌的傳染源，從而推進(jìn)了普通來源暴發(fā)的鑒定并且增強(qiáng)了流行病學(xué)調(diào)查。目前MLVA方法在沙門菌的流行病學(xué)調(diào)查和溯源的追蹤方面已經(jīng)顯示巨大的前景。Ross等［19］應(yīng)用 MLVA和噬菌體分型方法作為輔助工具用于鼠傷寒沙門菌流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果說明了MLVA和噬菌體分型能夠?yàn)樯抽T菌暴發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查提供不同的但是互補(bǔ)的信息。Torpdahl等［20］用 MLVA方法鑒定了一起由鼠傷寒沙門菌引起的區(qū)域暴發(fā)并且追蹤了其傳染源，所有的暴發(fā)菌株都有相同的噬菌體型、MLVA型和PFGE型，但是僅僅MLVA方法能將對照菌株和暴發(fā)菌株分開，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)一株來自豬群的菌株及其位于暴發(fā)相同地理區(qū)域的相應(yīng)的屠宰場與人源菌株有相同的PFGE和MLVA型別，結(jié)合流行病學(xué)資料證實(shí)了這次區(qū)域暴發(fā)是由豬群引起的鼠傷寒沙門菌噬菌體DT12型的區(qū)域感染。其他的研究也證實(shí)了MLVA在沙門菌尤其是相同沙門菌血清型的不同噬菌體型的菌株引起的多地暴發(fā)調(diào)查和溯源追蹤方面是一種非?？煽康墓ぞ撸?1－25］。

2.3 種系發(fā)生研究 MLVA除了用于沙門菌的分子流行病學(xué)研究外，還可以了解菌株間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。細(xì)菌的變異能夠根據(jù)在特異的染色體位點(diǎn)上的等位基因的變異所解釋，這是MLVA為群體遺傳分析和種系發(fā)生學(xué)推論提供了理論依據(jù)。Octavia和Lan［26］用9個(gè)位點(diǎn)的 MLVA方法分析傷寒沙門菌，73株分離自全球的菌株被分成70種不同的型別，種系發(fā)生分析顯示這些MLVA型別能被分成7個(gè)簇（cluster）。這些簇能被某些特定VNTR等位基因所支持，但是在每一個(gè)簇中并不是唯一包含這種特異的VNTR等位基因，因此認(rèn)為VNTR的數(shù)據(jù)過于分散，不能推論確鑿的親緣關(guān)系，但是種系發(fā)生分析可以使我們確定來自同一地區(qū)的菌株是否有流行病學(xué)聯(lián)系。但Chiou等［27］認(rèn)為基于較多VNTR位點(diǎn)組合的MLVA方法在建立菌株的種系發(fā)生關(guān)系時(shí)可能是一種非常有用的工具。他們確立了基于16個(gè)位點(diǎn)的MLVA方法描述鼠傷寒沙門菌的分型和種系發(fā)生研究，其中4個(gè)最可變的VNTR位點(diǎn)將183株不相關(guān)的鼠傷寒沙門菌和203株親緣關(guān)系相近的鼠傷寒沙門菌分別分成157和108種型，顯示了比PFGE更高的分辨率，尤其在親緣關(guān)系相近的菌株中。而這16個(gè)位點(diǎn)能將203株親緣關(guān)系相近的鼠傷寒沙門菌分成了118中不同的型別，種系發(fā)生樹分析呈現(xiàn)了4種不同簇，并且這4個(gè)簇分別與4種不同的噬菌體型相匹配，呈現(xiàn)了非常好的種系發(fā)生關(guān)系。因此基于一小組高度可變的位點(diǎn)的MLVA有極高的分辨率區(qū)分親緣關(guān)系相近的菌株，而基于一大組VNTR位點(diǎn)的MLVA方法更易于清楚的將菌株分成不同進(jìn)化組。在發(fā)展一種新的MLVA方案時(shí)，應(yīng)盡可能的找出基因組上所有的可能的VNTR位點(diǎn)。

3 展 望

VNTR位點(diǎn)的選擇對確保MLVA分型最優(yōu)操作參數(shù)具有重要意義，如太不穩(wěn)定的位點(diǎn)可能被包含進(jìn)去，這樣就不能完全反應(yīng)菌株基因型的真正的分布或者可能隱藏了一次暴發(fā)。因此MLVA分型方法中的VNTR位點(diǎn)組合在應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)化的分型方案前，需要進(jìn)行大量菌株的分析驗(yàn)證，包括對菌株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的長期傳代，然后對子代菌株再進(jìn)行分型分析，以確保每一個(gè)位點(diǎn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。MLVA方法另外一個(gè)缺點(diǎn)是目前同一種沙門菌血清型的測序株太少，往往所得到的VNTR數(shù)據(jù)只能從一株菌中或者與其他沙門菌血清型的測序株比較得到的。這種從一株菌中獲得的VNTR數(shù)據(jù)可能導(dǎo)致某些沙門菌血清型的跨越重復(fù)區(qū)域設(shè)計(jì)引物成為問題。因?yàn)檫@些側(cè)翼區(qū)域可能也是有多態(tài)性的［14］。而不同沙門菌血清型具有不同的遺傳學(xué)背景，一組特定的MLVA引物組合對某種沙門菌血清型有高度的分辨率，但是對其他的沙門菌血清型可能沒有分辨能力，因此篩選每一種沙門菌血清型的合適的MLVA位點(diǎn)不能依賴于其他血清型公布的基因組序列。隨著基因組測序技術(shù)的進(jìn)步，更多沙門菌血清型基因組被測序，MLVA必將在沙門菌的分子流行病學(xué)研究中得以廣泛的應(yīng)用，并且有可能替代PFGE方法作為沙門菌的主要分型方法［28－30］。

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R378.2

A

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中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所腹瀉病室/國家傳染病預(yù)防控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206

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