崔春愛,毛 翹,金德山,張慶鎬

(延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林延吉 133000）

神經(jīng)退行性疾病是一系列以神經(jīng)元凋亡為特征的神經(jīng)疾病的總稱,可導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶力下降,如阿爾茨海默病(alzheimer's disease,AD)、帕金森病(parkinson's disease)及亨廷頓病(huntington's disease,HD)等[1]。流行病學(xué)研究表明,長時間應(yīng)用非甾體類消炎藥可降低患AD的危險性,改善癥狀,但易導(dǎo)致胃腸道出血,長期服用時具有一定的危險性。肉豆蔻提取物是從肉豆蔻科高大喬木植物Myristica fragrans中提取的天然成分,常作食用佐料[2-3],并可抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的大鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞的激活及空間學(xué)習(xí)記憶的降低[4-6]。小膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫細胞,既可通過吞噬腦組織中的病原體及有害顆粒對神經(jīng)元起保護作用,又可在致炎因子的作用下激活成反應(yīng)性小膠質(zhì)細胞,分泌炎性細胞因子,對神經(jīng)元起毒性作用[7-8],是治療神經(jīng)炎癥及神經(jīng)退行性疾病的一個重要靶點[9-10],本課題主要對小膠質(zhì)細胞功能的調(diào)控進行研究,使其向保護神經(jīng)元的方向發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 小鼠小膠質(zhì)BV 2細胞購自韓國細胞株銀行;DM EM細胞培養(yǎng)基及小牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品;WST-8試劑盒為日本株式會社同仁化學(xué)研究所Dojindo產(chǎn)品;LPS、兔抗小鼠環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG及常規(guī)試劑均購自美國Sigma公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 小鼠小膠質(zhì)BV 2細胞以適量細胞密度接種于培養(yǎng)瓶中,加入含10%小牛血清、100 U/m L青霉素及100 μg/m L鏈霉素的DM EM 培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.3 WST-8法檢測 將對數(shù)生長期小鼠小膠質(zhì)BV 2細胞密度調(diào)整至1×105個/m L,接種于96孔板。將細胞分為對照組及肉豆蔻組。對照組加等量生理鹽水;肉豆蔻組用質(zhì)量濃度為10、20、50μg/m L的肉豆蔻提取物處理小鼠小膠質(zhì) BV2細胞。培養(yǎng)22 h后,加入WST-8試劑10μL/孔,再培養(yǎng)2 h,用450 nm波長測定吸光度。每組設(shè)8復(fù)孔、實驗重復(fù)3次,取平均值,檢測肉豆蔻提取物對小鼠小膠質(zhì)BV 2細胞生存率的影響。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察 將對數(shù)生長期小鼠小膠質(zhì)BV 2細胞密度調(diào)整至1×105個/m L,接種于直徑為60 mm的培養(yǎng)皿上,細胞貼壁后,實驗分對照組(等量生理鹽水)、谷氨酸組(谷氨酸終濃度為5μg/m L)及谷氨酸-肉豆蔻聯(lián)合組(終濃度為5μg/m L的谷氨酸及20μg/m L的肉豆蔻提取物),細胞分組處理24 h后,在倒置顯微鏡下進行觀察。

1.5 Western Blot檢測 接種于培養(yǎng)基的細胞完全貼壁后,實驗分對照組(等量生理鹽水)、LPS組(LPS終濃度為1μg/m L)及 LPS-肉豆蔻聯(lián)合組(終濃度為1μg/m L的LPS及終濃度分別為 10、20、50μg/m L的肉豆蔻提取物)。培養(yǎng)24 h后,在冰上收集細胞,提取蛋白質(zhì)。樣品上樣于10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠,在電壓70～100 V電泳 1.5～2 h,轉(zhuǎn)膜至二氟化樹脂膜(polyviny lidene fluoridemembrane,PVDF)上,5%脫脂奶粉封閉1 h,兔抗小鼠COX-2多克隆抗體(1∶1000)為一抗,HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5000)為二抗進行反應(yīng),增強型化學(xué)發(fā)光劑(enhanced chem iluminescence,ECL)顯色后觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Statuiew(SAS Inc)軟件,實驗數(shù)據(jù)采用t檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肉豆蔻提取物對小鼠小膠質(zhì)BV 2細胞生存率的影響WST-8法檢測顯示,肉豆蔻提取物作用于小鼠小膠質(zhì)BV 2細胞24 h,不同質(zhì)量濃度的肉豆蔻提取物組與對照組相比,細胞生存率無明顯影響(見圖1),表明肉豆蔻提取物對小鼠小膠質(zhì)BV2細胞無毒性作用。

圖1 肉豆蔻提取物對小鼠小膠質(zhì)BV2細胞生存率的影響

2.2 谷氨酸及肉豆蔻提取物對小鼠小膠質(zhì)BV2細胞形態(tài)學(xué)的影響 谷氨酸是小膠質(zhì)細胞被激活后產(chǎn)生的興奮性神經(jīng)毒物質(zhì),在神經(jīng)細胞缺血、缺氧、退行性病變及炎癥損傷等方面發(fā)揮重要作用。本實驗對照組的細胞呈圓形或橢圓形,細胞間連接緊密,生長旺盛(見圖2A);谷氨酸組細胞腫脹,部分細胞脫壁、懸浮,增殖減慢,細胞周圍碎片增多(見圖2B);谷氮酸-肉豆蔻聯(lián)合組細胞呈圓形或橢圓形,細胞間連接緊密,細胞生長旺盛(見圖2C),表明肉豆蔻提取物抑制了谷氨酸對小鼠小膠質(zhì)BV2細胞的損害作用,顯示其神經(jīng)保護作用。

圖2 小鼠小膠質(zhì)BV 2細胞的形態(tài)學(xué)觀察(倒置顯微鏡 ×40)

圖3 LPS和肉豆蔻提取物對小鼠小膠質(zhì)BV 2細胞COX-2表達的影響

2.3 LPS及肉豆蔻提取物對小鼠小膠質(zhì)BV 2細胞COX-2表達的影響 與對照組相比,LPS組COX-2的表達明顯增加,LPS(1μg/m L)分別與終濃度為10、20、50μg/m L的肉豆蔻提取物聯(lián)合處理后,COX-2的表達隨濃度的增加而減少(圖3A)。將Western Blot表達結(jié)果,運用Sigmap lot軟件進行量化,顯示LPS組與對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。LPS-肉豆蔻聯(lián)合組與 LPS組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(見圖3B),表明肉豆蔻提取物可抑制一些炎癥因子的釋放,具有抗炎作用。

3 討 論

AD是一種以進行性認知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD的關(guān)鍵性特征之一是腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)。β淀粉樣蛋白沉積,激活小膠質(zhì)細胞引起的炎癥反應(yīng)是其主要病理機制[11]。AD患者腦內(nèi)激活的小膠質(zhì)細胞,產(chǎn)生大量過氧化物、谷氨酸、一氧化氮、ATP、神經(jīng)生長因子(nerve grow th factor,NGF)及一些前炎癥細胞因子,具有潛在神經(jīng)毒性作用。M yristica fragrans是肉豆蔻科高大喬木植物肉豆蔻,具有抗血小板凝集、抗真菌及抗炎等多種作用[12-14]。本實驗肉豆蔻提取物作用于小鼠小膠質(zhì)BV2細胞24 h后,細胞生存率與對照組相比,無顯著差異,提示其對細胞無毒性作用;肉豆蔻提取物還可抑制由谷氨酸所導(dǎo)致的小鼠小膠質(zhì)BV 2細胞形態(tài)學(xué)改變,表明其對小膠質(zhì)細胞具有神經(jīng)保護作用。COX-2是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶,在受到 LPS及炎癥因子等刺激后,呈誘導(dǎo)型高表達,是炎癥過程中的誘導(dǎo)酶,通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)參與各種疾病的發(fā)病過程[15]。COX-2的表達調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平,即細胞受到細胞內(nèi)外的各種刺激后,經(jīng)過一系列的信號傳導(dǎo)促進COX-2轉(zhuǎn)錄及表達。LPS也稱為細菌內(nèi)毒素,可刺激大鼠神經(jīng)細胞產(chǎn)生炎癥因子。本課題前期研究采用微型滲透泵將LPS以0.25μL/h的速度自動注入大鼠第四腦室達28 d后,大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力受到影響,在大腦海馬區(qū)可見到大量被兔抗鼠單克隆OX-6抗體染成灰色的具有活性的小膠質(zhì)細胞[4]。本實驗中,LPS明顯增加小鼠小膠質(zhì)BV 2細胞的COX-2蛋白表達,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),與在體實驗相符;LPS與肉豆蔻提取物聯(lián)合處理后細胞COX-2的表達隨藥物濃度的增加而減少,與LPS組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義,提示肉豆蔻提取物發(fā)揮了抗炎作用。

綜上所述,肉豆蔻提取物抑制LPS所誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞的激活及炎癥因子的釋放,這可能是其抑制神經(jīng)炎癥的發(fā)生和發(fā)展,提高學(xué)習(xí)和記憶能力的重要機制之一。

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