王風(fēng)波, 李曉捷, 唐明薇

腦源性神經(jīng)生長因子(brain-derived neuotrophic factor,BDNF)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、抵抗傷害性刺激的能力、促使神經(jīng)元損傷后修復(fù)等方面均具有重要的作用,對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及損傷的治療有著極高的價(jià)值和前景。研究顯示,BDNF蛋白表達(dá)升高的時(shí)間與腦損傷的治療窗相吻合,BDNF陽性表達(dá)水平亦隨著腦的發(fā)育而變化,并與腦損傷有直接的關(guān)系[1]。目前已有研究證據(jù)顯示,電針可上調(diào)腦內(nèi)BDNF的表達(dá)水平,促進(jìn)損傷及壞死灶周圍正常神經(jīng)元軸突芽生,使新的突觸形成,并減少神經(jīng)元凋亡[2]。本實(shí)驗(yàn)正是基于上述研究成果和理論依據(jù),采用宮內(nèi)感染致仔鼠腦損傷模型,用陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法來觀察腦的皮質(zhì)區(qū)BDNF陽性表達(dá)情況,進(jìn)而研究宮內(nèi)感染對(duì)仔鼠的各時(shí)期腦組織BDNF陽性表達(dá)影響,推測(cè)早期電針干預(yù)提高神經(jīng)可塑性和損傷后修復(fù)的物質(zhì)基礎(chǔ)及可能機(jī)制,為臨床治療提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)成熟W istar大鼠60只,雌性40只,雄性20只,體質(zhì)量≥220 g,由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào):黑動(dòng)字D99102001號(hào))提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 脂多糖(血清型055∶B5,美國SIGMA公司);羊抗兔BDNF多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB顯色液等(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 腦損傷模型制備 將雌、雄性大鼠室溫(21±1)℃下常規(guī)飼養(yǎng),自由飲食,明暗周期各半(12 h/12 h)。環(huán)境適應(yīng)2周后,于17時(shí)雌雄比例以2∶1合籠,次日上午8時(shí)行陰道涂片檢查,查到精子為妊娠第0天,孕鼠另籠飼養(yǎng)。將31只孕鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為生理鹽水組(n=6)和脂多糖組(n=25)。孕17 d的脂多糖組孕鼠給予脂多糖450μg/(kg·d),連續(xù)2 d腹腔注射,生理鹽水組孕鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水。孕22 d前分娩的仔鼠為早產(chǎn)鼠,兩組均去除早產(chǎn)鼠。仔鼠出生后取胎盤做蘇木精-伊紅染色觀察宮內(nèi)感染情況,判斷標(biāo)準(zhǔn)為大量中性粒細(xì)胞浸潤。

1.4 分組方法 按隨機(jī)數(shù)表法選取生理鹽水組仔鼠32只為對(duì)照組,脂多糖組仔鼠56只;脂多糖組仔鼠再按隨機(jī)數(shù)表法分為非干預(yù)組32只,電針組24只。

1.5 干預(yù)方法 電針組仔鼠7日齡開始進(jìn)行電針干預(yù),每日1次,干預(yù)至28日齡。選取百會(huì)、曲池及足三里為干預(yù)穴位,參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[3]及王琴玉等[4,5]方法,具體操作是:結(jié)合人與動(dòng)物骨度類比,頂骨正中定百會(huì);橈骨近端的關(guān)節(jié)外側(cè)前方凹陷中取曲池;膝關(guān)節(jié)后外側(cè)之腓骨小頭下約5mm處取足三里。以直徑0.2 mm、長20mm的華佗牌針灸針,平刺入百會(huì),進(jìn)針后覺針下沉緊即可。各穴均連接至電針儀,連續(xù)波,頻率5～10 H z,強(qiáng)度以頭部輕微抖動(dòng)為度,一般3～5 V,持續(xù)10 min。對(duì)照組、非干預(yù)組仔鼠均常規(guī)飼養(yǎng)。

1.6 觀察指標(biāo) 對(duì)照組和非干預(yù)組仔鼠于24 h各處死8只行腦組織病理學(xué)、BDNF表達(dá)檢測(cè)。各組分別于14、21、28日齡行腦組織BDNF表達(dá)檢測(cè)。

1.7 腦組織BDNF檢測(cè) 采用SABC免疫組織化學(xué)染色法,陰性對(duì)照用磷酸鹽緩沖液代替一抗。BDNF陽性細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn):棕黃色免疫陽性顆粒主要分布在胞漿和細(xì)胞膜表面,主干樹突和近細(xì)胞膜的胞漿處染色較深,而胞體中央細(xì)胞核處染色較淺。每例腦組織于皮質(zhì)區(qū)取4張切片,每張切片在顯微鏡(×400)下隨機(jī)取4個(gè)相互不疊加視野,計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量資料以 x±s表示,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎盤病理改變及新生仔鼠腦組織病理改變 與對(duì)照組仔鼠相比,脂多糖組仔鼠出生后顏色青紫、活動(dòng)少、肌肉顫動(dòng)、翻身不能等。脂多糖組孕鼠胎盤病理檢測(cè),可見胎盤內(nèi)血管充血、水腫,大量中性粒細(xì)胞浸潤;對(duì)照組孕鼠胎盤病理檢測(cè)未見炎癥反應(yīng)。脂多糖組仔鼠腦白質(zhì)組織疏松,血管擴(kuò)張,膠質(zhì)細(xì)胞聚集,腦室內(nèi)出血等;對(duì)照組仔鼠腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)完整有序,核仁清楚。

2.2 不同時(shí)期3組仔鼠腦組織BDNF陽性細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組及非干預(yù)組仔鼠1日齡腦組織BDNF陽性反應(yīng)皆欠均勻,陽性細(xì)胞數(shù)量少,胞漿著色相對(duì)較深,細(xì)胞輪廓模糊,突起染色欠佳,胞核無著色;非干預(yù)組BDNF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)3.147±0.776,多于對(duì)照組1.547±0.653,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.48,P<0.01)。隨著日齡增加,各組仔鼠BDNF陽性細(xì)胞數(shù)量均逐漸增多,在21日齡達(dá)高峰,細(xì)胞輪廓漸清晰,染色增強(qiáng),部分細(xì)胞可見淡染的短突起,28日齡呈下降趨勢(shì);非干預(yù)組與對(duì)照組在各日齡BDNF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);電針組在各日齡BDNF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯高于非干預(yù)組與對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組仔鼠不同日齡腦組織BDNF的陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)比較( x±s,n=8)

3 討論

宮內(nèi)感染是導(dǎo)致新生兒腦損傷的重要致病因素,與腦性癱瘓密切相關(guān)。自胚胎18 d至生后25 d是大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵期,此期內(nèi)隨日齡增加,新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體等逐漸增多,腦在結(jié)構(gòu)和功能上具有很強(qiáng)的可塑性。與人類相比,15日齡大鼠的腦發(fā)育水平與1周歲兒童相當(dāng),28～30日齡大鼠與2周歲兒童相當(dāng),而0～2歲是兒童腦發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期,中樞神經(jīng)系統(tǒng)逐漸發(fā)育成熟。在大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)分布廣泛的BDNF可提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的存活能力,改善受損神經(jīng)元的病理狀態(tài),促進(jìn)其再生及分化成熟,因而可防止神經(jīng)元受損至死亡。在神經(jīng)元的發(fā)育、生長過程中,BDNF具有調(diào)節(jié)突觸傳遞,促進(jìn)突觸生長和突觸重塑等作用,隨機(jī)體發(fā)育成熟其水平逐漸降低,并維持在較低水平。研究發(fā)現(xiàn),新生大鼠腦組織BDNF陽性表達(dá)在第20～25天達(dá)到高峰,之后呈遞減趨勢(shì)[1]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在發(fā)育生長過程中,各組仔鼠腦組織BDNF的陽性反應(yīng)均越來越強(qiáng),陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)越來越高,在21日齡達(dá)到高峰,28日齡呈下降趨勢(shì),這與寧曉霞等[6]的研究結(jié)果基本一致。與對(duì)照組相比,1日齡非干預(yù)組BDNF陽性反應(yīng)較強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),此后兩組間在各日齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這與彭洪軍等[7]研究結(jié)果基本一致。不同日齡電針組仔鼠腦組織BDNF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯高于對(duì)照組和非干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。1日齡非干預(yù)組BDNF陽性反應(yīng)強(qiáng)于對(duì)照組,可能與胎鼠的腦受損時(shí)間有關(guān),表明宮內(nèi)感染所致腦損傷可刺激中樞神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞等合成、分泌BDNF增加,而后對(duì)腦損傷仔鼠進(jìn)行的早期電針干預(yù)更明顯增強(qiáng)了腦組織BDNF的陽性反應(yīng),符合BDNF對(duì)中樞神經(jīng)元的營養(yǎng)、支持和受損后的修復(fù)作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)仔鼠腦組織蘇木精-伊紅染色病理檢查結(jié)果,更說明宮內(nèi)感染可導(dǎo)致仔鼠腦白質(zhì)損傷。

宮內(nèi)感染造成仔鼠腦組織BDNF陽性反應(yīng)增強(qiáng)可能是通過以下機(jī)制:(1)炎癥反應(yīng)激活淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子能進(jìn)一步激活胎盤血管內(nèi)皮細(xì)胞,促使微血栓形成,導(dǎo)致胎盤與胎兒間的血液循環(huán)障礙,使胎兒宮內(nèi)缺血、缺氧、腦內(nèi)能量代謝降低;(2)使大量細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+蓄積,致Ca2+超載;(3)透過血腦屏障進(jìn)入胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥產(chǎn)物激活腦內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞,引起血管栓塞;(4)刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生,表達(dá)細(xì)胞因子、一氧化氮、黏附分子等,產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng);(5)促進(jìn)興奮性氨基酸釋放,以N-甲基門冬氨酸受體蛋白受體作中介,誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。這些因素最終都能刺激中樞神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞等合成和分泌BDNF增加。

BDNF對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用可能是通過提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)抗代謝性和興奮性氨基酸毒性損傷的能力,維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平,穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,抵抗一氧化氮介導(dǎo)的谷氨酸細(xì)胞毒性,調(diào)節(jié)自由基代謝,減少自由基在神經(jīng)元內(nèi)的積聚。

針灸治療腦損傷及后遺癥歷史由來已久,療效毋庸置疑,對(duì)于穴位的選擇,中醫(yī)理論認(rèn)為:百會(huì)穴屬督脈,統(tǒng)領(lǐng)一身陽氣,與腦關(guān)系密切,針灸督脈可補(bǔ)腦益髓;曲池、足三里屬陽明經(jīng)合穴,具醒腦開竅之效,針刺合穴可增強(qiáng)氣血運(yùn)行,促進(jìn)閉塞經(jīng)脈疏通,尤其適用于治療腦損傷致運(yùn)動(dòng)障礙。臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),根據(jù)Brodm ann分區(qū),電針曲池穴可以激活同側(cè)初級(jí)軀體運(yùn)動(dòng)區(qū)、輔助運(yùn)動(dòng)區(qū)、雙側(cè)初級(jí)軀體感覺區(qū)及雙側(cè)額上回等中樞區(qū)域[8]。故選用針灸督脈百會(huì)穴及陽明經(jīng)合穴作為腦損傷治療方案,可以振奮周身之陽氣,疏經(jīng)通絡(luò),補(bǔ)氣益血,提升氣血運(yùn)行,促進(jìn)肢體功能康復(fù)。電針治療集針刺與電刺激功效于一身,療效明顯優(yōu)于單純針刺或電刺激,是現(xiàn)代針灸學(xué)最常用之治療方法。

本實(shí)驗(yàn)于第7日齡開始電針干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組和非干預(yù)組相比,電針組仔鼠腦組織BDNF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),說明電針干預(yù)可以上調(diào)腦損傷動(dòng)物腦組織BDNF表達(dá)水平,促進(jìn)受損神經(jīng)的再生與修復(fù)。同時(shí),電針組的BDNF陽性表達(dá)高峰同樣出現(xiàn)在21日齡,28日齡出現(xiàn)下降趨勢(shì),與其他組表現(xiàn)趨勢(shì)一致。電針促使腦損傷后腦組織BDNF陽性反應(yīng)增強(qiáng)。牛小梅[9]研究分析后認(rèn)為其可能機(jī)制是:保護(hù)尼氏體使神經(jīng)元內(nèi)蛋白質(zhì)較正常的合成,促使中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)處于活躍狀態(tài),增加內(nèi)源性保護(hù)因子的表達(dá)等。本實(shí)驗(yàn)雖僅從BDNF角度觀察和研究電針對(duì)腦損傷的治療作用,但通過對(duì)已研究證實(shí)的BDNF生物學(xué)效應(yīng)的分析,進(jìn)一步證實(shí)了電針可通過提高BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子水平進(jìn)而增強(qiáng)腦損傷后的神經(jīng)修復(fù)功能,為臨床治療腦性癱瘓等小兒腦損傷提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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