杭瑜瑜

(瓊州學院理工學院，海南三亞572022)

早在19世紀末H.Royer＆Bert Hite等人就利用高壓殺死牛奶、果汁、蔬菜汁中的微生物［1］.超高壓處理滅菌的同時有效保留食品的色澤、風味和營養(yǎng)成分［2］，目前已成為一種有效的物理殺菌方法［3］.Alemen等［4］指出，在室溫下(25℃)600MPa以下的壓力即可殺滅一般微生物的營養(yǎng)細胞，而殺死細菌芽孢和真菌孢子在室溫下需要1000MPa甚至以上的壓力［5］.

超高壓與保鮮劑協(xié)同處理對微生物的干擾作用明顯增強.經(jīng)超高壓處理后，微生物細胞膜被破壞［6］，加速了保鮮劑的滲透.采用超高壓與保鮮劑協(xié)同處理既可解決壓力增大所帶來的設備體積和成本增大的要求，又可達到良好的殺滅微生物的效果［7］.

茶多酚是一種良好的天然抗菌劑，對19個細菌類群的12個類群近100種細菌均有抑制作用.茶多酚對金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、傷寒沙門氏桿菌、志賀氏痢疾桿菌、銅綠色假單孢桿菌、枯草桿菌、口腔變異鏈球菌、大腸埃希氏桿菌 8種致病菌的最低抑制濃度分別為 0.08%、0.01%、0.03%、0.04%、0.08%、0.08%、0.1%、0.1%［8］.本文對茶多酚協(xié)同超高壓殺滅枯草芽孢桿菌進行了研究，以期尋找有效地降低殺菌壓力的方法.

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種枯草芽孢桿菌1.1474，購于中國科學院微生物所.

1.1.2 試驗試劑固體培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，用15%氫氧化鈉校正pH至7.4)，分裝，121℃滅菌15min備用.液體培養(yǎng)基:營養(yǎng)肉汁(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水1000mL，用15%氫氧化鈉校正pH至7.4)，分裝，121℃滅菌15min備用.

菌種經(jīng)活化后，接入液體培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)48h.

無菌生理鹽水(0.85%的氯化鈉水溶液)，K2HPO4、KH2PO4、茶多酚(純度98%，杭州浙大茶葉科技有限公司).

1.2 試驗儀器與設備超高壓處理裝置(HPB.A2—600/0.6)，天津市華泰森淼生物工程技術有限公司;真空包裝機(DZD－400/2s)，江蘇騰通包裝機械有限公司;超凈工作臺(SW－CJ－2FD)，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;高壓蒸汽滅菌鍋(AMA240/440)，英國ASTELL公司;生化培養(yǎng)箱(LRH－250A)，廣東省醫(yī)療器械廠.

1.3 試驗方法

1.3.1 超高壓處理為了保證枯草芽孢桿菌營養(yǎng)體與芽孢穩(wěn)定的比例，將其37℃，140r/min震蕩培養(yǎng)約48h，然后5000r/min離心15min，棄上清液，沉淀下的菌體用無菌生理鹽水洗滌一次，再以pH6.8磷酸緩沖液制成菌懸液，調(diào)整細胞濃度，使起始菌數(shù)N0為109cfu/mL，然后將其分裝于l0mL的無菌聚乙烯塑料袋，并加入相應量的茶多酚，真空包裝、冷藏備用，每一樣品重復3次.高壓容器的溫度通過其夾套內(nèi)恒溫水浴來控制，將供試樣品提前幾分鐘置于高壓容器介質(zhì)中，待樣品溫度與高壓介質(zhì)溫度達到平衡后，進行超高壓處理.處理后立即進行微生物計數(shù).同時取未經(jīng)超高壓處理的菌懸液作為對照.

1.3.2 微生物數(shù)量測定根據(jù)中華人民共和國國家標準食品衛(wèi)生微生物學檢驗方法(GB/T4789－2003)檢測經(jīng)超高壓處理和未處理(對照樣)的菌懸液的菌落數(shù)(單位:cfu/mL)

1.3.3 試驗方法設計采用統(tǒng)計軟件Design－Expert 7.0.0的Pentagonal模式，以壓力和茶多酚濃度2個因子為自變量，分別以X1、X2表示，并根據(jù)現(xiàn)有試驗條件、研究經(jīng)驗及研究報道，其取值范圍確定為100～500MPa和0.5～1.5mg/mL，同時固定處理溫度為20℃和處理時間為10min.按方程xi=(Xi－X0)/△X對自變量進行編碼(xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為試驗中心點處自變量的真實值，△X為自變量的變化步長)，并以自變量的編碼值+1、0、－1分別代表自變量的高、中、低水平的編碼值，超高壓處理后殘存的枯草芽抱桿菌的對數(shù)數(shù)量級Y為響應值(Y=Iog10Nt，其中Nt為超高壓處理后菌懸液中的活菌數(shù))，試驗自變量因素編碼及水平見表1.

表1 試驗因素水平及編碼

假設由最小二乘法擬合的二次多項方程為:Y=B0+Blx1+B2x2+B12x1x2+B11x12+B22x22

其中 Y= －Iog10Nt，B0為常數(shù)項，B1、B2分別為線性系數(shù)，B12為交互項系數(shù)，B11、B22為二次項系數(shù).為了求得此方程的各項系數(shù)，至少須8組試驗來求解.試驗設計及結(jié)果見表2.

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 回歸方程的建立及其顯著性檢驗采用統(tǒng)計軟件Design－Expert7.0.0進行試驗設計并優(yōu)化出來的8組試驗安排以及結(jié)果見表2.

表2 試驗設計及結(jié)果

采用Design Expert 7.0.0對表2數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到兩元一次回歸模型方程為:

對該模型進行方差分析，結(jié)果見表3，模型系數(shù)顯著性檢驗見表4.

表3 回歸模型方差分析

方差來源 平方和 自由度 均方 F值 p值0.044 1 0.044 4.35 0.1724 x22 8.279E －003 1 8.279E －003 0.82 0.4615殘差 0.11 5 0.022失擬項 0.091 3 0.030 3.01 0.2593純誤差 0.020 2 0.010總和 9.09 7模型的確定系數(shù)R －Squared=0.9978 x12模型的調(diào)整確定系數(shù)Adj R －Squared=0.9922

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

對表3、4的數(shù)據(jù)進行分析可得出如下結(jié)果:

(1)模型p值=0.0056＜0.05表明模型極顯著，不同處理間的差異極顯著;失擬項 P=0.2593＞0.05，模型的失擬度不顯著.(2)模型的調(diào)整確定系數(shù)RAdj2=0.9922，說明該模型能解釋99.22﹪響應值的變化，模型擬合程度良好.該模型在本實驗規(guī)定自變量變化范圍內(nèi)，可以用此模型對茶多酚協(xié)同作用下超高壓殺滅枯草芽抱桿菌進行分析和預測.(3)由回歸系數(shù)顯著性檢驗可知，模型中 x1(p=0.0012 ＜0.05)、x2(p=0.0127 ＜0.05) ，交互項及二次項均不顯著.

2.2 茶多酚協(xié)同超高壓殺菌的響應曲面分析X1和X2對響應值的影響如圖1所示.

圖1 Y=f(X1，X2)的響應曲面和等高線

從圖1的等高線圖中可以看出:壓力恒定，隨著茶多酚濃度的增大，殘存的枯草芽抱桿菌數(shù)量級Y值隨之減少，但是其減少幅度不大;茶多酚濃度恒定，隨著壓力的增大，殘存的枯草芽抱桿菌數(shù)量級Y急速減少.從等高線或回歸方程可以得出:X1=300MPa，X2=1.0mg/mL時，Y=4.28;X1=300MPa，X2=1.5mg/mL 時 Y=3.72;X1=500MPa，X2=1.0mg/mL 時，Y=2.47.

2.3 茶多酚協(xié)同超高壓殺菌工藝的優(yōu)化和回歸模型的檢驗為了確保在以上8組試驗基礎上所建回歸模型的準確性，并且優(yōu)化出若干組具有較好的殺菌效果的超高壓殺菌工藝參數(shù)，如果把超高壓殺菌技術應用于食品工業(yè)，因考慮到食品原料污染的微生物指數(shù)一般不大于104cfu/g(或cfu/mL)，首先用上述回歸模型預測優(yōu)化出10組微生物數(shù)量≤104cfu/mL的工藝參數(shù).再按照10組優(yōu)化工藝參數(shù)進行試驗驗證，利用統(tǒng)計軟件Design Expert進行分析，結(jié)果見表5.

由表5可以看出，回歸模型預測優(yōu)化出10組殘存的枯草芽孢桿菌數(shù)量≤104cfu/mL的2種自變量參數(shù)取值范圍是:壓力為346.72～481.80MPa，茶多酚濃度為0.89 ～ 1.47mg/mL.按照上述10組殺菌工藝參數(shù)進行超高壓驗證實驗，結(jié)果證明實現(xiàn)了殘存的枯草芽抱桿菌數(shù)量級Y≤4的目標，平均相對誤差為3.26%.充分說明方程模型是合適有效的.

表5 回歸模型所優(yōu)化的10組響應預側(cè)值≤4的殺菌工藝參數(shù)以及驗證結(jié)果

3 結(jié)論

研究了茶多酚協(xié)同超高壓處理對枯草芽孢桿菌的殺滅效果，采用響應曲面方法中的Pentagonal模式，對壓力和茶多酚濃度2個因素進行了優(yōu)化設計.試驗結(jié)果表明:(1)壓力、茶多酚濃度是影響超高壓殺滅枯草芽孢桿菌的顯著影響因素，分析表明其顯著度順序為壓力＞茶多酚濃度.(2)在本試驗條件范圍內(nèi)建立的超高壓殺滅枯草芽抱桿菌的回歸模型有效，并可用于預測本試驗條件范圍內(nèi)以及附近取值的枯草芽抱桿菌超高壓殺菌結(jié)果.(3)優(yōu)化得出10組殘存枯草芽孢桿菌對數(shù)數(shù)量級≤4的工藝參數(shù)的取值范圍為:壓力為346.72 ～481.80MPa，茶多酚濃度為0.89 ～1.47mg/mL.

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