卓先勤，林 怡，邵東旭

(瓊州學院理工學院，海南三亞572022)

前言

β－葡萄糖苷酶 (EC3，2，1，21)，英文名是:beta glucosidase，屬于水解酶類，又稱纖維二糖酶。它的特性是可水解結(jié)合于末端、非還原性的β－D－糖苷鍵，同時釋放β－D－葡萄糖和相應的配基［1］。β－葡萄糖苷酶在自然界廣泛分布，幾乎在所有的生物體中都存在，因其來源不同而β－葡萄糖苷酶的性質(zhì)各異，在人類的糖原降解和動植物、微生物的糖類代謝方面具有重要的生理功能。

β－葡萄糖苷酶具有高度的耐熱穩(wěn)定性而對纖維質(zhì)糖化工業(yè)，尤其是固定化酶催化反應極為有利;在有機介質(zhì)中酶法合成具有生理活性的烷基糖苷類化合物，產(chǎn)率比水相反應大大提高;加入金屬離子會對酶活性有不同程度的激活或抑制作用;不同的pH對酶的活性也有不同程度的影響;酶活測定以及酶催化反應也存在最佳反應時間。此外，由于β－葡萄糖苷酶因其來源不同而性質(zhì)各異。鑒于上述這些因素，研究了溫度、pH、有機溶劑、金屬離子和反應時間對實驗室篩選的菌株所產(chǎn)β－葡萄糖苷酶活性的影響，對今后β－葡萄糖苷酶的催化機理及糖基化修飾方面的研究具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器米曲霉(Aspergillus oryzae)為實驗室保藏.

培養(yǎng)基:斜面培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂15 g，水1000mL，pH 自然.)、種子培養(yǎng)基［2］(可溶性淀粉2%，葡萄糖1%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.1%，酵母膏0.5%，NaNo3 0.2%，PH 自然)、產(chǎn)酶培養(yǎng)基(麩皮 4%，KH2PO4 0.2%，(NH4)2SO4 0.2%，醋酸鈉 0.1%，抗壞血酸 0.1%，MgSO4 0.1%，尿素 0.2%%)。

試劑:水楊苷購于中國藥品生物制品檢定所;二氧六環(huán)、已腈、叔丁醇等均為分析純.

儀器:凈化工作臺，THZ－82恒溫振蕩培養(yǎng)箱，752型紫外分光光度計，真空冷凍干燥儀等。

1.2 β－葡萄糖苷酶粗酶的制備將所需菌種米曲霉在無菌條件下接入斜面培養(yǎng)基(PDA)，30℃培養(yǎng)72 h.斜面菌種接人種子培養(yǎng)基，30℃搖床培養(yǎng)42 h.將培養(yǎng)好的菌體按l0%接種量接人到發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，150 r/min搖床培養(yǎng)88 h，取出發(fā)酵液，4000 r/min離心10 min，收集上清液，測酶活力［2］。

1.3 β－葡萄糖苷酶的性質(zhì)研究1mL β－葡萄糖苷酶粗酶液溶于2 mL 0.1 mol/L pH 4.8醋酸－醋酸鈉緩沖液，研究在不同溫度、pH、時間、有機溶劑和不同的金屬離子條件下β－葡萄糖苷酶的活性.水楊苷法測酶活［3］。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對酶活力的影響在一定條件下，每一種酶只有在某一溫度時表現(xiàn)最大活性，即最適溫度。在pH為4.8的粗酶緩沖液，加入水楊苷，分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃保溫20min后 ，立即冷卻，適當稀釋，以加熱失活的酶液作空白，按水楊苷法測定其酶活［3］。

結(jié)果如圖1所示，隨著溫度的升高，酶活力逐漸增大，但是當溫度升高到50℃時 ，酶活力開始下降。由此可見，該酶作用的最適溫度為50℃。

圖1 溫度對酶活力的影響

圖2 pH對酶活力的影響

2.2 pH對酶活力的影響將粗酶緩沖液分別調(diào)至不同pH值，于50℃保溫20min，適當稀釋后測其酶活力，結(jié)果如圖2所示，該酶作用的最適 pH為5.0。

2.3 反應時間對酶活力的影響將pH 5的粗酶緩沖液，于50℃分別保溫5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min，適當稀釋后測其酶活力，結(jié)果如圖3所示，保溫20min是最佳反應時間。

圖3 保溫時間對酶活力的影響

圖4 溫度對酶穩(wěn)定性的影響

2.4 β－葡萄糖苷酶的穩(wěn)定性在pH為5.0的粗酶緩沖液中，加入水楊苷，30、40、50℃分別保溫10、20、40、60h，測剩余酶活力，結(jié)果見圖 4。

結(jié)果表明，隨著反應時間的延長，酶活力越來越小，到60h后酶活力幾乎都為0.為了提高酶催化反應的效率，反應的時間不宜太短，溫度應低于酶活最適溫度.因此，酶催化水解反應及逆水解合成反應的溫度以45℃為宜，反應時間最好不超過40h。

2.5 β－葡萄糖苷酶對有機溶劑的耐受性將β－葡萄糖苷酶冷凍干燥制成酶粉，將酶粉置于不同溶劑含量的不同有機溶劑中，在40℃恒溫水浴中保溫20min，立即冷卻，適當稀釋，測定有機溶劑對β－葡萄糖苷酶活性的影響.所選溶劑為合成烷基糖苷常用的三種有機溶劑［4］，結(jié)果見表1。

表1 β－葡萄糖苷酶在不同濃度有機溶劑中的活性(OD值表示)

結(jié)果表明，對于三種有機溶劑來說，20%有機溶劑濃度條件下，β－葡萄糖苷酶很容易失活，說明低濃度的有機溶劑是酶的失活劑.80%和90%濃度條件下β－葡萄糖苷酶的活力較高，其中酶活力最高的是90%的二氧六環(huán).因而后續(xù)的催化合成反應以90%的二氧六環(huán)(10%的緩沖液)作為反應介質(zhì).

2.6 金屬離子對酶活力的影響在pH5的粗酶緩沖液中，加入水楊苷，加入不同的金屬離子，50℃保溫20min后，測定其相對酶活 (不添加金屬離子的酶活為100%)，結(jié)果見表2.

表2 金屬離子對β－葡萄糖苷酶活性的影響(相對酶活表示)

結(jié)果表明，Ca2+、Ba2+對酶有激活作用，與文獻［5］的結(jié)果相一致;Hg2+、Fe3+、Cu2+、Ag+對酶有顯著的抑制作用 ;K+、Na+、Mn2+、Mg2+對酶活的影響不大，與文獻［6］的研究結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

β－葡萄糖苷酶酶活測定的最適條件為:pH 5，50℃水浴中反應20min;酶催化反應:90%的二氧六環(huán)(10%緩沖液)作為反應介質(zhì)，pH 5，45℃，反應 40小時;Ca2+、Ba2+對酶有激活作用，Hg2+、Fe3+、Cu2+、Ag+對酶有顯著的抑制作用.該研究對后續(xù)實驗中β－葡萄糖苷酶的分離純化，酶活測定，糖基化修飾，以及糖基化合物改性都具有重要的意義。

［1］王華夫，游小青.茶葉中β－葡萄糖苷酶活性的測定［J］.中國茶葉，2003(3):16－17.

［2］顧衛(wèi)民，郭海風，沈愛光.β－葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌、發(fā)酵條件的優(yōu)化、粗分離及其特性研究［J］.江蘇食品與發(fā)酵，2007(4):12－16.

［3］楊挺.β－葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.貴陽金筑大學學報，2008，2.

［4］Gabin V，Jacques B，Dominique L B，Jean－Marc M，Daniel T.The novel disaccharides by a newly isolated fructosyl transferase from Bacillus subtilis［J］..Enzyme and Microbial Technology，2009(11):212 －218.

［5］王冬梅，李多川，孟軍.嗜熱子囊菌光孢變種 Thermoascus aurantiacus var.1evisporus β－葡萄糖苷酶的分離純化及特性研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2005，24(5):1007 －1012.

［6］李平，宛曉春，丁霄霖，陶文沂.黑曲霉β－葡萄糖苷酶的活力測定和酶學性質(zhì)［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學學報，1998，25(3):304－309.