雷 霆 陳志國(guó) 周 軍 肖 剛
陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院(陜西咸陽(yáng)712000)
門脈高壓性胃病 (PHG)系指門脈高壓病所伴發(fā)的一種特殊類型的胃黏膜病變,是引起上消化道出血的重要因素之一。在重度肝功能不全患者及重度PHG患者中,PHG為第1位出血因素[1]。本研究通過(guò)建立PHG大鼠模型,應(yīng)用白及三七混劑治療 PHG,觀察血漿中血小板 4因子(PF4)和可溶性 P-選擇素(SPS)的變化,探討其治療PHG出血的機(jī)制。
1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 白及三七混劑 (白及粉200mg/kg、三七粉200mg/kg加入沸水,晾涼后制成糊劑);云南白藥 (國(guó)藥準(zhǔn)字Z53020798,產(chǎn)品批號(hào):20090607);10%水合氯醛;青霉素鈉(哈藥集團(tuán)總廠生產(chǎn),生產(chǎn)批號(hào):C080101417)。
1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠40只,雌雄各半,育齡6~8周,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)自西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,合格證編號(hào):SCXK(陜)2007-001。
1.3 試劑與儀器 酶聯(lián)免疫試劑由西安阿爾寶生物技術(shù)有限公司提供試劑盒(48孔配置)。高速臺(tái)式離心機(jī)(北京安亭醫(yī)用離心機(jī)廠);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司,SW-CJ-ID型);低溫冰箱(三洋公司MDF-U332型);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(國(guó)營(yíng)華東電子管廠DG5031型);電子天平(上海第二分析儀器廠FA 2004N型);顯微鏡(德國(guó)Leica公司DM40008型)。
1.4 分組及造模[2-5]40只健康SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組、模型組、白及三七混劑組及云南白藥組。除假手術(shù)組外,其余3組采用1期門靜脈縮窄加左腎上腺靜脈結(jié)扎法復(fù)制大鼠PHG模型。10%水合氯醛(0.3mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠,正中切口入腹,游離出門靜脈,用9號(hào)針頭作內(nèi)支撐,縮窄門靜脈橫經(jīng)約90%,再將左腎上腺靜脈結(jié)扎。假手術(shù)組只游離門靜脈和左腎上腺靜脈,不縮窄或結(jié)扎。2周后隨機(jī)自手術(shù)組選取2只及假手術(shù)組1只處死,取肝組織行苦味酸-天狼紅染色,按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝纖維化組織學(xué)Ⅵ級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肝纖維化程度評(píng)判對(duì)照,鏡下觀察肝纖維形成,示模型制備成功[6]。
1.5 給藥方法及標(biāo)本采集 白及三七混劑組按1mL/100g每日給予白及三七等混劑灌胃(400mg/kg);云南白藥組按1mL/100g每日予云南白藥灌胃(400mg/kg);假手術(shù)組及模型組大鼠正常喂養(yǎng)。給藥7d后處死大鼠,采取血樣標(biāo)本,待測(cè)。
1.6 檢測(cè)指標(biāo) 選擇檸檬酸鈉作為抗凝劑,與血樣標(biāo)本混合10~20min,2000~3000r/min離心20min左右, 仔細(xì)收集上清液,即為血漿成分,將所有處理好的血樣進(jìn)行酶聯(lián)免疫法測(cè)定吸光度(OD值),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中大鼠PF4和SPS質(zhì)量濃度。
2.1 病理學(xué)檢查結(jié)果 PHG模型病理切片 (×40)觀察結(jié)果顯示:胃黏膜下小血管管壁增厚,管腔擴(kuò)張,單位視野下數(shù)目增多(如圖1A),肝組織匯管區(qū)小血管擴(kuò)張,假小葉形成,少數(shù)肝細(xì)胞呈現(xiàn)雙核增生改變(如圖1B)。
圖1 PHG模型大鼠病理組織切片圖
2.2 各組血漿中SPS和PF4水平比較 見表1。白及三七混劑組與云南白藥組大鼠血漿中PF4和SPS的含量與模型組比較明顯升高(P﹤0.01);但白及三七混劑組和云南白藥組比較,PF4和SPS的含量無(wú)明顯差異(P<0.05)。
表1 各組血漿中SPS、PF4水平比較 (ng/mL
表1 各組血漿中SPS、PF4水平比較 (ng/mL
與模型組比較,*P<0.01;與假手術(shù)組比較,△P<0.05,△△P<0.01。
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建立穩(wěn)定的肝硬變門脈高壓癥模型是肝硬變門脈高壓癥基礎(chǔ)性研究的前提[7]。本實(shí)驗(yàn)采用門靜脈縮窄加左腎上腺靜脈結(jié)扎法,成功誘導(dǎo)出較理想的大鼠肝硬變門靜脈高壓癥胃病模型。該方法特點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)性肝硬變?cè)谛纬蛇^(guò)程中歷經(jīng)肝細(xì)胞變性壞死、纖維組織增生及假小葉形成等幾個(gè)階段,這與人類肝硬變自然演變過(guò)程基本一致。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)中證實(shí),采用PHG腎上腺靜脈結(jié)扎法,造模15d后,大鼠門靜脈壓穩(wěn)定在較高水平(測(cè)定腸系膜前靜脈分支靜脈壓平均大于10mmHg),胃底黏膜及黏膜下動(dòng)靜短路早期出現(xiàn)并異常開放,并且其胃黏膜具有特征性病理變化,類似于臨床上PHG患者的胃腸黏膜變化[8]。該方法造模成功率高,復(fù)制簡(jiǎn)單易行,符合本課題的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基本要求。
肝硬化門脈高壓對(duì)血小板功能的影響是一個(gè)復(fù)雜問(wèn)題,涉及到血小板結(jié)構(gòu)、形態(tài)、生理生化性質(zhì)等多方面的改變。血小板在止血過(guò)程中起作用,除依賴于血小板的數(shù)量外,血小板的功能狀態(tài)也極其關(guān)鍵。研究結(jié)果表明,肝硬化患者血小板黏附、活化和聚集能力顯著低于正常,提示血小板功能異常在肝硬化患者的出血傾向中起著非常重要作用[9]。國(guó)內(nèi)曾有報(bào)道,肝硬化門脈高壓時(shí)血小板功能不同程度降低,其中通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),血塊收縮異常者占77.8%,血小板黏附率降低者占66.7%,PF4減少者占78%,血小板聚集率降低者占77.8%,血小板第3因子有效性減少者占 65.7%[10]。
本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),模型組較假手術(shù)組PF4及SPS指標(biāo)均明顯下降,說(shuō)明肝硬化PHG時(shí)血小板凝血功能各項(xiàng)參數(shù)將不同程度上發(fā)生改變,血小板活化能力出現(xiàn)不同程度下降表現(xiàn),這一結(jié)果極可能是PHG并發(fā)上消化道出血的主要原因之一。如果臨床治療上選用一些能夠有效改善血小板活化能力的藥物,那么PHG并發(fā)上消化道出血機(jī)率將會(huì)顯著降低。
白及三七混劑中諸藥雖然都有止血,活血散瘀的功效,但是由于各成分的相互作用,其綜合作用絕不是單味藥的簡(jiǎn)單疊加,還可能會(huì)出現(xiàn)新的作用。通過(guò)筆者近年臨床應(yīng)用證實(shí):白及三七混劑在PHG急慢性出血治療上是一種安全、價(jià)廉、有效、無(wú)毒副作用重要藥物,該藥物圍手術(shù)期治療中結(jié)合中醫(yī)辨證加減后,可以使患者得到有效的合理的個(gè)體化治療。
筆者選取云南白藥作為對(duì)照組,白及三七混劑作為治療組,仔細(xì)觀察其對(duì)血小板凝血功能指標(biāo)變化的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):云南白藥及白及三七混劑均能夠升高PF4及SPS指標(biāo),改善血小板活化能力,提高機(jī)體的凝血功能,有效地促進(jìn)止血過(guò)程進(jìn)行,但兩者彼此之間治療效果接近。藥理研究表明:云南白藥能促進(jìn)血小板聚集,增強(qiáng)血小板活化百分率及血小板表面糖蛋白表達(dá),能縮短血液凝血時(shí)間,使傷口出血時(shí)間及凝血酶原時(shí)間縮短,對(duì)動(dòng)脈血管有明顯收縮作用。因此,臨床上應(yīng)用白及三七混劑治療PHG出血的作用機(jī)理可能應(yīng)該與血小板活化功能提高有關(guān)。其具體機(jī)制可能是:血小板表面多種受體經(jīng)混劑所產(chǎn)生的膠原物質(zhì)誘導(dǎo)刺激,迅速發(fā)生蛋白磷酸化反應(yīng),激活了血小板,引起釋放反應(yīng)發(fā)生,形成或釋放出組織因子,進(jìn)一步激活凝血系統(tǒng)中的多種凝血因子,從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)促凝過(guò)程,其表現(xiàn)出迅速有力的止血作用。PHG時(shí)血小板活化能力會(huì)降低,這可能是PHG合并上消化道出血原因之一。白及三七混劑在PHG出血治療中是一種可行的方法,具有一定的臨床實(shí)用價(jià)值,其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究探討。
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